[논문]단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단

이형송; 김민지; 강인수

초록
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착상전 유전진단은 유전질환이 이환될 가능성이 있는 부부들을 대상으로 산전진단을 통한 임신중절의 위험성 없이 정상적인 아이를 가질 수 있게 도와주는 보조생식술의 한 방법으로 확립되었다. 단일 할구를 대상으로 하는 분자생물학 및 분자생물학적 기술의 발전은 착상전 유전진단의 정확성을 높은 수준에 이르게 하였고 whole genome amplification 방법을 이용함으로써 단일세포로부터 여러 가지 다양한 진단을 동시에 수행 가능케 하였으며 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단에서의 오진을 감소시킬 수 있었다. 따라서 PCR을 이용한 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단의 적용가능 유전질환은 더욱 확대될 것이며 건강한 아이의 출산을 원하는 더 많은 부부들에게 기회를 제공해 줄 것이다. 본 종설에서는 현재 단일유전자 질환에 대한 착상전 유전진단을 시행하는 대부분의 센터에서 시행하고 있는 생검 방법과 multiplex PCR, PCR 후 진단 방법, 그리고 multiple displacement amplification 등의 분자생물학적 방법과 단일 세포 분석에서의 문제점 등을 포함한 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단 전반에 관하여 논의할 것이다.

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Preimplantation genetic diagnosis (PGD) has become an assisted reproductive technique for couples who are at risk that enables them to have unaffected baby without facing the risk of pregnancy termination after invasive prenatal diagnosis. The molecular biology and technology for single-cell genetic...

Preimplantation genetic diagnosis (PGD) has become an assisted reproductive technique for couples who are at risk that enables them to have unaffected baby without facing the risk of pregnancy termination after invasive prenatal diagnosis. The molecular biology and technology for single-cell genetics has reached an extremely high level of accuracy, and has enabled the possibility of performing multiple diagnoses on one cell using whole genome amplification. These technological advances have contributed to the avoidance of misdiagnosis in PGD for single gene disorders. Polymerase chain reaction (PCR)-based PGD will lead to a significant increase in the number of disorders diagnosed and will find more widespread use, benefiting many more couples who are at risk of transmitting an inherited disease to their baby. In this review, we will focus on the molecular biological techniques that are currently in use in the most advanced centers for PGD for single gene disorders, including biopsy procedure, multiplex PCR and post-PCR diagnostic methods, and multiple displacement amplification (MDA) and the problems in the single cell genetic analysis.

주제어

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문제 정의

이는 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단의 경우 정확한 분자생물학적 기술과 이를 분석할 수 있는 능력 등이 뒷받침되어야 한다는 것을 의미한다. 따라서 본 연구에서는 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단을 중심으로 착상전 유전진단의 임상적 적용, 분자생물학적 진단 기법, 그리고 본원의 사례에 대해 알아보고자 한다.
따라서 PCR을 이용한 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단의 적용가능 유전질환은 더욱 확대될 것이며 건강한 아이의 출산을 원하는 더 많은 부부들에게 기회를 제공해 줄 것이다. 본 종설에서는 현재 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단을 시행하는 대부분의 센터에서 시행하고 있는 생검 방법과 multiplex PCR, PCR 후 진단 방법, 그리고 multiple displacement amplification 등의 분자생물학적 방법과 단일 세포 분석에서의 문제점 등을 포함한 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단 전반에 관하여 논의할 것이다.

제안 방법

본 환자의 경우 DMD 환자인 남동생이 있는 보인자 여성으로서 gender selection을 위한 amelogenin과 polymorphic marker인 STR44 그리고 pERT84-15-XmnI marker를 사용하여 triplex nested fluorescent PCR 방법과 fragment analysis 방법을 이용하여 착상전 유전진단을 시행하였다(Fig. 8). 연관 markers의 사용으로 ADO rate를 감소시킬 수있었으며 또한 X-염색체 연관 유전질환의 특성상 여성 배아의 경우 이식하지 않는 경우가 자주 보고되어 왔으나 이러한 informative linked markers의 사용으로 보인자와 정상 배아를 확실하게 구분할 수 있게 되어 이식 가능 배아의 수를 증가 시킬 수 있었다⁷⁾.
내원 당시 가계 내에 이환된 환자가 없는 26세의 여성 환자로서 collagen 합성에 중요한 역할을 하는 Col1A1 유전자에 de novo 돌연변이를 갖고 있었다. 이 부부의 경우 nested PCR 과 direct sequencing 방법을 사용하여 착상전 유전진단을 시행하였고 건강한 남아를 출산하였다(Fig. 6).
이 부부의 경우 부인은 phenylalanine hydroxlase 유전자 (PAH)의 exon 11 c.1068C>A 돌연변이, 남편은 exon 6 c.526C>T 돌연변이를 각각 가지고 있는 보인자로 밝혀졌으며 2개의 돌연변이를 동시에 진단하기 위해 duplex nested PCR을 시행하였고, 그 산물을 이용하여 direct sequencing 방 법으로 진단하여 정상 배아만을 이식하였으며 역시 임신에 성공하여 건강한 아이를 출산하였다(Fig. 7).
Q425P)를 가지고 있는 것으로 확인되었다. 이들 부부 각각 ITGB4에 돌연변이를 가지고 있었기 때문에 ITGB4 exon 7과 11에 대해 duplex nested PCR 방법으로 증폭시킨 후 direct sequencing 방법으로 진단을 하였으며 이들 부부 역시 임신에 성공하여 건강한 아이를 출산하였다⁴¹⁾.

대상 데이터

본원에 내원한 부부의 경우 남편의 CAG 반복서열이 27/69로서 한 allele이 확장되어 있었으며, 부인의 경우에는 26/32 반복서열로 정상이 었다. MJD1의 CAG 반복서열을 증폭할 수 있는 primer를 고안 하여 fluorescent semi-nested PCR 방법과 fragment analysis 방법을 이용하여 착상전 유전진단을 시행한 결과 정상 배아만을 진단할 수 있었으며 건강한 아이를 출산하였다³⁸⁾ (Fig. 9).
내원 당시 가계 내에 이환된 환자가 없는 26세의 여성 환자로서 collagen 합성에 중요한 역할을 하는 Col1A1 유전자에 de novo 돌연변이를 갖고 있었다. 이 부부의 경우 nested PCR 과 direct sequencing 방법을 사용하여 착상전 유전진단을 시행하였고 건강한 남아를 출산하였다(Fig.
본 환자의 경우 내원 당시 페닐케톤뇨증 환자 아들을 둔 32세의 여성이었으며 1번의 자연유산과 융모막 융모생검을 통한 1번의 인공유산 후 착상전 유전진단을 위해 본원에 내원하였 다. 이 부부의 경우 부인은 phenylalanine hydroxlase 유전자 (PAH)의 exon 11 c.
본 환자의 경우 첫 임신 당시 정상분만을 통해 여아를 출산하였으나 23개월 만에 수포성 표피박리증으로 사망하였으며, 그후 네 번의 임신 경험이 있었으나 출산 후 사망하거나 양수천자와 융모막 융모생검을 통해 돌연변이가 발견되어 인공유산을 시켰고 착상전 유전진단에 의한 임신을 위해서 본원에 내원하였다. 이들 부부의 질환 원인은 17번 염색체에 위치하고 있는 integrin β4 유전자(ITGB4)에서의 돌연변이로 밝혀졌으며 부부가 각각 서로 다른 위치에 1개씩의 돌연변이를 가지고 있는 것으로 확인되었다.

이론/모형

본원에 내원한 환자의 경우 남편은 28/31 CAG 반복서열로 정상이었지만, 부인의 경우 CAG 반복서열이 27/62로 한 allele이 확장되어 있었다. 정확한 반복서열을 진단하기 위해 fluorescent semi-nested PCR 방법을 사용하여 착상전 유전진단을 시행하였다³⁸⁾ (Fig. 10).

성능/효과

착상전 유전진단은 유전질환이 이환될 가능성이 있는 부부들을 대상으로 산전진단을 통한 임신중절의 위험성 없이 정상적인 아이를 가질 수 있게 도와주는 보조생식술의 한 방법으로 확립되었다. 단일 할구를 대상으로 하는 분자생물학 및 분자생물학적 기술의 발전은 착상전 유전진단의 정확성을 높은 수준에 이르게 하였고 whole genome amplification 방법을 이용함으로써 단일세포로부터 여러 가지 다양한 진단을 동시에 수행 가능케 하였으며 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단 에서의 오진을 감소시킬 수 있었다. 따라서 PCR을 이용한 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단의 적용가능 유전질환은 더욱 확대될 것이며 건강한 아이의 출산을 원하는 더 많은 부부들에게 기회를 제공해 줄 것이다.
단점으로는 첫째, 배아의 mosaicism을 들 수 있으며 이럴 경우 분리해 낸 할구의 유전형이 나머지 배아 전체의 유전형이라 할 수 있는가 하는 문제점이 있다. 둘째, 염색체 mosaicism이나 우성 유전질환, 그리고 염색체 이상에 대한 오진을 감소시키기 위해 2개의 할구 에서 같은 진단 결과가 나온 경우에만 이식을 하는 경우가 있는데 이럴 경우 정확한 진단을 위해 사용할 수 있는 세포 수와 생검 후 남은 할구의 수가 적다는 것이다.
본원에서 시행한 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단의 경우 X-염색체 연관 유전질환인 DMD (근 이영양증)를 가장 많이 시행하였으며, 상염색체 우성 유전질환으로는 osteogenesis imperfecta (골형성부전증), 상염색체 열성 유전질환으로는 epidermolysis bullosa (수포성 표피 박리증)과 phenylketonuria (페닐케톤뇨증)을 많이 시행하였고, 삼핵산 반복서열 유전질환으로는 fragile X syndrome (FXS), spinocerebellar ataxia 3 (SCA3), Huntington’s disease (HD) 등을 시행하였다.
위의 2가지 방법보다수정란에 가장 영향을 미치지 않으며, 사용이 간단하고 구멍 크기 조절이 가능하며 정확한 위치에 구멍을 뚫을 수 있다. 또한 작업 시간이 짧아 많은 배아를 처리할수 있는 장점이 있다.

후속연구

단일 할구를 대상으로 하는 분자생물학 및 분자생물학적 기술의 발전은 착상전 유전진단의 정확성을 높은 수준에 이르게 하였고 whole genome amplification 방법을 이용함으로써 단일세포로부터 여러 가지 다양한 진단을 동시에 수행 가능케 하였으며 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단 에서의 오진을 감소시킬 수 있었다. 따라서 PCR을 이용한 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단의 적용가능 유전질환은 더욱 확대될 것이며 건강한 아이의 출산을 원하는 더 많은 부부들에게 기회를 제공해 줄 것이다. 본 종설에서는 현재 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단을 시행하는 대부분의 센터에서 시행하고 있는 생검 방법과 multiplex PCR, PCR 후 진단 방법, 그리고 multiple displacement amplification 등의 분자생물학적 방법과 단일 세포 분석에서의 문제점 등을 포함한 단일 유전자 질환에 대한 착상전 유전진단 전반에 관하여 논의할 것이다.
이를 뒷받침하기 위해 단일세포 수준에서의 매우 높은 분자생물학적 기술의 정확성이 요구될 것이며 또한 단일 세포로부터 여러 가지 진단을 동시에 수행하기 위한 MDA와 같은 whole genome amplification 같은 기술의 발전 또한 이루어져야 할 것이다. 이러한 분자생물학적 기술들의 발전으로 착상전 유전진단은 더욱 정확하고 안전한 진단방법으로 발전해 나아갈 것이며, 더 많은 사람들에게 건강한 아이의 출산 기회를 제공해 줄 것이다.
단일 유전자 질환뿐만 아니라 염색체의 수적, 구조적 이상, 습관성 유산, 그리고 최근에는 HLA typing 또는 late onset disease 같은 질환으로까지 그 적용 범위가 점차 확대되어 가고 있다. 이를 뒷받침하기 위해 단일세포 수준에서의 매우 높은 분자생물학적 기술의 정확성이 요구될 것이며 또한 단일 세포로부터 여러 가지 진단을 동시에 수행하기 위한 MDA와 같은 whole genome amplification 같은 기술의 발전 또한 이루어져야 할 것이다. 이러한 분자생물학적 기술들의 발전으로 착상전 유전진단은 더욱 정확하고 안전한 진단방법으로 발전해 나아갈 것이며, 더 많은 사람들에게 건강한 아이의 출산 기회를 제공해 줄 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	착상전 유전진단은 질환의 원인과 그에 따른 진단 방법에 따라 주로 무엇으로 구분할 수 있는가?	착상전 유전진단은 질환의 원인과 그에 따른 진단 방법에 따라 주로 염색체의 수적, 구조적 이상을 진단할 수 있는 FISH (fluorescence in situ hybridization, 형광직접보합법) 방법과 질환 원인 유전자의 돌연변이 등을 진단할 수 있는 PCR 방법으로 크게 구분할 수 있다. 이 중에서 PCR 방법을 이용하여 단일 유전자 질환(single gene disorders)에 대한 착상전 유전진단을 시행하는 센터는 전세계적으로 90여 센터에 불과한 것으로 알려져 있다4).
	착상전 유전진단의 장점은 무엇인가?	착상전 유전진단(preimplantation genetic diagnosis, PGD)은 1990년 처음 보고된 진단 방법으로 유전질환이 이환된 아이를 출산할 확률이 높은 부부들을 대상으로 착상전 배아 단계에서 단일 유전자 질환(single gene disorder)이나 염색체의 수적, 구조적 이상 유무를 진단한 후 질환이 이환되지 않은 배아만을 선별하여 이식함으로써 유전적으로 정상적인 태아의 임신을 가능케 도와주는 방법이다1). 이러한 진단 방법은 임신이 된 후 임신 기간에 따라 양수천자(amniocentesis), 융모막 융모생검법(chorionic villi sampling) 등을 통하여 채취한 태아의 세포를 대상으로 각각의 유전질환이나 염색체 이상을 진단하는 기존의 산전진단(prenatal diagnosis, PND)과는 다르게 착상전에 진단이 이루어지기 때문에 임신중절에 따르는 육체적, 정신적 고통을 최소화할 수 있으며 생명 존엄에 따르는 윤리적인 문제 또한 극복할 수 있다는 장점이 있다. 또한 착상전 유전진단 적응증의 하나인 염색체 이상으로 인한 반복 자연유산(recurrent pregnancy loss) 또는 반복적인 착상 실패(repeated implantation failure)의 경우 대체로 산전진 단이 가능한 시기 이전에 유산이 일어나기 때문에 산전진단을 시행할 수 있는 시기 이전에 이환 유무를 진단할 수 있는 대체 방법이 필요하며, 이러한 여러 가지 측면에서 착상전 유전진단은 매우 효과적이며 유용한 방법이라 할 수 있다.
	착상전 유전진단이란 무엇인가?	착상전 유전진단(preimplantation genetic diagnosis, PGD)은 1990년 처음 보고된 진단 방법으로 유전질환이 이환된 아이를 출산할 확률이 높은 부부들을 대상으로 착상전 배아 단계에서 단일 유전자 질환(single gene disorder)이나 염색체의 수적, 구조적 이상 유무를 진단한 후 질환이 이환되지 않은 배아만을 선별하여 이식함으로써 유전적으로 정상적인 태아의 임신을 가능케 도와주는 방법이다1). 이러한 진단 방법은 임신이 된 후 임신 기간에 따라 양수천자(amniocentesis), 융모막 융모생검법(chorionic villi sampling) 등을 통하여 채취한 태아의 세포를 대상으로 각각의 유전질환이나 염색체 이상을 진단하는 기존의 산전진단(prenatal diagnosis, PND)과는 다르게 착상전에 진단이 이루어지기 때문에 임신중절에 따르는 육체적, 정신적 고통을 최소화할 수 있으며 생명 존엄에 따르는 윤리적인 문제 또한 극복할 수 있다는 장점이 있다.

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