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문제 정의
- 1«"하이」「。 대표 처방인 四物湯이 뇌허혈로 유발된 신경세포 손상을 방어하는 효과가 있을 것으로 사료되어 본 연구를 시행하여 유의한 결과를 얻었기에 보고 하는 바이다.
가설 설정
- Fig. 2. Effect of SMT on expression of TUNEL positive apoptotic c1 in the pyramidal cells layer CA1 region in the hippocampus after transient cerebri ischemia. Histograph shows changes in the number of TUNEL positive cells that was counted by image anysis software in the CA1.
- Histograph shows changes in the number of TUNEL positive cells that was counted by image anysis software in the CA1. The number of rats in each group is 3. Vues are mean±S.D. * Denotes significant difference between ischemia and SMT (0<O.O1).
제안 방법
- 是하 glutamate -"- 시에 하 5「'上"'-시--이 힝 니〕시 『와이 DNA μ夕디 시이I U 기-의알아보기 위하여 SMT 150 律/ml를 2시간 전처리하고 3 mN19' glutamate를 ;니히-이 12시 罚이 O补 후 DAPI 염색을 하여 현미경으로 관찰하였으며, 갇 .二 W丄 HIT앙하 — 죄彳却이 DNA" -*-하여 -시 牛징, * 시시礼。工씨 DNA『신 F 싱" μ 찰하였다.
- 职앙시普이 』니시이세 50 mg/ml工 "圳 하이 시-용하였다. 신, ''"—시 기지 "屮 2 시"I 시에 SM를 경〒 투여하였고, HT22 세포에서 glutamate 처리 2시간 전에 SMT를 처리하였다.
- 4)로 실온에시 5μ 간 K、h히-이 乎아FU μ 지하있니. 해마의 CA1 피라미드 세포의 중앙부 1 mm 거리에서 화상자동분석시스템 (Image-Pro Plus)을 이용하이 TUNEL 인七 节" 계측하였다.
- 』 내의 LDH 함량을 측정하여 대조군과 비교함으로써 세포의 사멸이나 또는 세포막의 파괴를 검정할 수 있니. 마l牛시 glutamate이I -。' 히- HT22 세포의 LDH 함량에 미치는 四物湯의 효과를 알아보고자 배양액 내의 LDH를 측정한 결고}, 읺utamate를 단독처리한 f세시', 내조구과 川皐히-이 200% 이시 측정되있으나 SMT를 전처리한 실험군에서는 170% 이하로감소되어 이utamate에 의한 손상에 내해 SMT의 방어 효과를 확인하였다.
- Glutamate 에 의한 hydrogen peroxide 생성은 형광 probe 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) 로 반응시킨 후 측정하였다 배양한 HT22 세포를 SM와 glutamate를 처리한 후 PBS로 2번 세척하고DCF-DA 10 W로 30분 간 염색한 다으 다시 PBS 로 세척하고 형광현미경으로 관찰하였다.
- Glutamate에 의해 유도되 HT22 세포사멸에 내한 凸物湖의 효과를 알아보기 위하여 HT22 세포에 다양한 농도의 SMT를 2시간 전처리하고 3 mM의 glutamate를 12시간 처리하여 세포생존율을 측정하였다.
- HT22 세포의 glutamate에 의한 세포고사에서 세포의 형태학적인 변화와 이에 대한 四物湯의 효과를 알아보기 위하여 HT22 세포에 150 ”g/ml의 SMT를 2시간 전처리한 다으 3 nW의 이utamate를 처리하고 12시간이 경과한 후 DAPI를 이용하여 헥을 염 색 하였다 DAPI 염색을 시행한 결고}, 정상 내조 군의 핵은 온전한 형태의 균질한 형광염색을 나타내었다 (Fig. 5A). 그러나 glutamate 처리구의 배양세포 흐{ 은 염 색사가 응축되어 형광염 색 강도가 증가되고 여러 조각으로 분절된 형광절편이 관찰되었디<FIg.
- Western blot 김 사법으로 관찰된 단백질의 발현 정도를 분석하기 위하여 스캐너를 이용하여 PVDF 막에 발색된 단백질의 양상을 컴퓨터에 저장하였다 분석 프로그램 Image-Pro를 이용하여 단백질 발현량을 측정하였다.
- biotin-dUTP nick-end labeling (TUNEL) 염색 TUNEL 염색은 in situ apoptosis detection kit (Roche)를 사용하였다. 4% paraformaldehyde로 고정 한 뇌절편 (35 ㎛)을 슬라이드 글라스에 부착시키고 1주일 간 실온에서 건조시켰다.
- 06% bromophenol blue] 를 섞어 3분 간 끓는 물에 중탕하여 변성을 유도하고 8% SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 실시하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 (Millipore Co.) 으로 transfer 장치 (Pharmacia Bio.)를 이용하여 120eA의 전기를 걸어주면서 이동시킨 후, blocking buffer (3% skim milk를 함유한 Tween20-Tris buffer (TBST))로 상온에서 30분 간 반응시켜 비특이적 항체반응을 억제시켰다. 특이적인 항체인 PARP (Santa Cruz Bio.
- 세포가 파괴되면 유출되어 세포의 비가역적인 손상의 지표로서 사용되는 LDH를 이용하여 glutamate 에 의해 유도된 HT22 세포에서 LDH 함량에 미치는 四物湯의 효과를 알아보기 위하여 HT22 세포에 SMT (150”g/ml)를 2시간 전처리하고, 3皿의 glutamate를 12시간 처리하여 배양액 내로 유출된 LDH 의 함량을 측정하였다. 그 결고}, 이utamate를 처리하지 않은 내조군과 비교하여 glutamate를 처리한 군에서는 220±25%로 나타났으나, SMT를 전처리한구에서는 175±20%로 나타나 LDH 함량이 유의하게감소되었다 (Fig.
- 하기 言。싱-的n=6), 니f -이히」'-허혈 손상을 유발시킨 실험군(n=6)으로 나누었다.
- )를 1:1,000으로 희석시킨 후 PVDF 막을 넣어 4(、에서 하룻바 동안 반응시켰다. 이차항체인 anti rabbit IgG-AP (Santa Cruz Bio.)를 TBST에 1:1, 000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 NBT와 BCIP 발색용액에 넣어 발색시켰다
- 허혈 손상 후 TUNEL 염색기밥을 이용하여 해마 CA1 의 피라미드 세프층에서 DNA 분절현상을 동반한 신경세포 고사를 관찰하였다. 이때 TUNEL 양성 세포는 진한 갈색의 핵을 가지고 있는 것으로 관찰되었다.
- 흰쥐에 SMT (250 ㎎/㎏)를 2시간 전에 경구 투여한 후 TiO2 microsphere를 이용하여 영구적 국소 뇌 허혈을 유발시킨 다으 24시간 후에 붉은색의 formazan을 형성하므로써 세포 생존을 측정하는 TTC 염색을 실시하였다. 생리식염수를 투여하고 허혈을 유발시킨 흰쥐 뇌의 해마 부위는 붉게 염색되지 않았으나, SM를 투여한 후 허혈을 유발시킨 흰쥐 뇌의 해마 부위는 생리식염수 투여군에 비하여 붉은 색이 균일하게 염색되었다 (Fig.
대상 데이터
- Mouse hippocampal cell line 인 HT22 cell을 CO2 <I"'니 잉. 牛』시 (37— 5% CO2) 10% Fetal bovine serum (FBS) 이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)에서 48시간 주기로 계대 배양하였으며, 실험에는 6 well plate에 well 당 2x105 세포"" 12시《〕9이I 이:" 二 니外이 3「上牛"n 이μ니 "«工하 ]이 신a* 하있니.
- 유래하였으며. 이구니아"- 이비인후과학 교실로부터 분양받아 계대 배양하였다.
- 본 실험에서 사용한 HT22 세포주는 mouse의 해 叫5壬이E 유래하였으며. 이구니아"- 이비인후과학 교실로부터 분양받아 계대 배양하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균 (means) 士 표준편차 (S.D.) 로 나타내었으며, 실험구 간의 통계 처리는 Kruskall-Wallis test를 이용하였다. p값이 0.
이론/모형
- DNA 분절현상을 알아보기 위한 genomic DNA 추출은 Herrmann 등22)의 방법을 이용하였다. 먼저 SMT가 처리된 세포를 회수하여 PBS로 세척한 후 cell lysis buffer (1% NP40 in 20mM EDTA, 50mM Tris-HCl, pH 7.
- Glutamate 세포독성에 의한 세포내부의 변화를알아보기 위하여 세포고사 과정에 참여하게 되는 PAml의 발현양상을 PARP 항체를 사용하여 Western blotting을 시행하였다. Glutamate를 처리한 세포군에서 정상적인 크기인 116 kDa의 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)단백의 발현이 감소되었으며, protease에 의하여 cleavage가 일어나는 것으로 예상되는 85 kDa 크기의 PARP 단백 의 발현은 증가되었디I SeT를 전처리하고 glutamate를 처리한 구에서는 glutamate 단독 처리한 군과 비교하여 116 kDa 의 PARP 발현이 증가되었으며, 85 kDa 크기의 PARP 단백 발현은 glutamate 단독 처 리구에 비교하여 유의하게 감소되었다(Fig.
- Glutamate에 의한 HT22 세포고사에서 ROS 가 관여하는 지를 알아보기 위하여 DCF-DA 염색 방법으로 ROS 생성을 관찰하였다. 형광의 정도는 ROS 축적의 지표로 볼 수 있다.
- 세포 활성도 측정은 MTT assay를 이용하였다21). 6 well plate 이I ml 닌- 2T0'』이 <I", 하이 CO’"』"-〕이-이]시 이 f! 와시기」「- 12시 J하였다.
- 영구적 국소 뇌허혈 손상은 Gerriets 등20)이 고안한 microsphere 모델을 이용하였다. 실힘동물에 10% chloral hydrate(100 ㎎/㎏)를 복강 주사하여 마취 후 앙와위로 고정하고 수술현미경하에서 정상적으로 심장으로부터 뇌까지 혈류를 유지하면서 직경 0.
성능/효과
- 시행하였다. Glutamate를 처리한 세포군에서 정상적인 크기인 116 kDa의 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)단백의 발현이 감소되었으며, protease에 의하여 cleavage가 일어나는 것으로 예상되는 85 kDa 크기의 PARP 단백 의 발현은 증가되었디I SeT를 전처리하고 glutamate를 처리한 구에서는 glutamate 단독 처리한 군과 비교하여 116 kDa 의 PARP 발현이 증가되었으며, 85 kDa 크기의 PARP 단백 발현은 glutamate 단독 처 리구에 비교하여 유의하게 감소되었다(Fig. 7).
- MTT assay 측정 시 glutamate를 처리하지 않은 내조구과 비교하여 glutamate에 의해 55±6.8%로 감소되었던 세포생존율이 SMT를 150 您/ml의 농도로 전처리한 군에서는 세포생존율이 86±4.6%로 나타나 유의하게 증가되었다 (Fig. 3).
- 함량을 측정하였다. 그 결고}, 이utamate를 처리하지 않은 내조군과 비교하여 glutamate를 처리한 군에서는 220±25%로 나타났으나, SMT를 전처리한구에서는 175±20%로 나타나 LDH 함량이 유의하게감소되었다 (Fig. 4).
- 염색을 실시하였다. 생리식염수를 투여하고 허혈을 유발시킨 흰쥐 뇌의 해마 부위는 붉게 염색되지 않았으나, SM를 투여한 후 허혈을 유발시킨 흰쥐 뇌의 해마 부위는 생리식염수 투여군에 비하여 붉은 색이 균일하게 염색되었다 (Fig. 1).
- 세포고사 과정에서 전형적으로 나타나는 DNA 분절현상을 관찰하고 세포고사에 대한 四物湯의 효과를 관찰하기 위하여 HT22 세포에 S3를 150, 保/血의 농도로 2시간 전처리한 다으 3 mM glutamate를 처리하여 DNA를 추출한 후 1.5% agarose gel에 전기영동 하여 ethidium bromide 염색을 통하여 확인하였다그 결과, glutamate 단독처리 에 의한 DNA 분절현상이 SMT 전처리군에서는 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 6).
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