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문제 정의
- 보고는 없었다. 따라서 저자는 염증반응과 알레르기성 질환의 병태생리에 중요한 역할을 하는 비만세포의 항알레르기 약리효과를 규명하기 위하여 compound 48/80에 의한 흰쥐 복강 비만세포 (Rat peritoneal mast cell)의 탈과립, 히스타민 유리 및 혈관투과성의 증가에 사물탕이 미치는 영향을 알아보고, 사물탕이 Human Mast Cell line (HMC-1 Cel1) 에서 PMA plus A23187 의한 IL-6, IL-8Z TNF-a의 분비에 어떠한 영향을 미치는지를 밝히기 위하여 본 연구를 실시하였다.
가설 설정
- Inverted light micrographs of rat peritoneal mast cells (RPMC) in HEPES-Tyrode buffered solution. A: The normal RPMC (arrows) in HEPES-Tyrode buffered solution show dear, smooth outline, spherical shape and central located nucleus, and contain many refractive granules in their cytoplasm. x1000, B, C, D: The RPMC (arrows) obsered wifhin 10 minutes after the addition of SMT solution (B; 5 mg /ml, C; 1 mg/ml, D; 0.
- a) Anti-DNP igE was injected into dorsal skin sites. after 48 h, SMT (14, 91 mg/100g) was administered orally 1 h prior to the challenge with antigen (DNP-HSA).
- b) Each amount of dye is presented as the mean士SEM. three independent experiments, c) The patch of evans blue was measured 30 min after antigen (DNP-HSA) injection, d) Weight of evans blue patch was measured 30 min after antigen (DNP-HSA) injection. ** p<0, 01.
제안 방법
- 동안 정지시켰다. 1,000배의 배율 하에서 비만세포를 위상차 도립현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 정상 비만세포의 형태는 대부분 원형 또는 난원형으로 세포윤곽이 뚜렷하고, 세포질 내에는 많은 과립들이 충만되어 있었다.
- 주사한 48시간 후에 DNP-human serum albumin 100 ㎍(100 ㎕)을 포함하는 4% Evans blue (1:4) 를 음경등 쪽정맥 내로 주입하였다. DNP-HSA로 감작 (challenge) 시키기 1시간 전에 SMT 14.91 mg/100g 을 1 mi의 D.W에 녹여 구강 투여하였다 피부반응 유발여부와 양성반응 판정은 4% Evans blue 용액을 주입하고 30분이 경과한 뒤 등쪽 피부를 절개하여 주사한 부위의 진피에서 파란색 반점이 나타나는지의 여부를 관찰하였다. 그리고 파란색 반점이 나타난 주사부위의 피부를 절취하여 3-4 mm정도의 작은 조각으로 세절하고 5 ml의 formamide 용액에 넣어 40 ℃ oven에서 24시간 (overnight) 동안 Evans blue 용액을유출시켰다.
- Well plate을 washing 하고 avidin-peroxidase을 첨가하여 37℃에서 30분 반응시켜 주고 다시 washing 한 후 ABTS substrate 을 첨가 한 후 실온에서 10분 정도 반응시켰다. ELISA leader를 사용하여 wave length 405 nm에서 O.D 값을 측정하였다.
- 그 방법12)은 다음과 같다. HMC-1 Cells (3xl05 cells/500 ㎕)를 24 well plate 에 분주하고 CO2 incubator (5% CO2 37℃)에서 30분 정도 안정화 시킨 후 SMT (0.1z 1 또는 5 mg /ml) 을 24시간 동안 전처리 했다. 각 well에 MTT assay solution 50 ㎕을 첨가하여 37P에서 4시간 동안 반응시켰다.
- PCA 반응은 Kim 등의 방법을 수정, 보완하여 사용하였다 먼저 anti-DNP IgE 에 의한 PCA반응을 유발하기 위하여 pentothal sodium (중외제약, 대한민국) 로 마취 후 수컷 흰 쥐의 등 쪽 털을 제거한 다음 진피내로 anti-DNP IgE 0.5 ㎍ (50 ㎕)을 주입하였다. 주사한 48시간 후에 DNP-human serum albumin 100 ㎍(100 ㎕)을 포함하는 4% Evans blue (1:4) 를 음경등 쪽정맥 내로 주입하였다.
- SMT7에 compound 48/80에 의한 비만세포의 활성화 억제 정도를 알아보기 위하여 비만세포를 SMT에 10분 반응시킨 후 compound 48/80용액 25 ㎕를 비만세포 부유액에 넣어 20분 동안 반응시켰다.
- 5 ㎍ /ml) 25 ㎕을 첨가하여 반응시켰다. SMT가 단독으로 비만세포의 histamine 을 유리시키는지 알아보기 위하여 SMT (최종농도 : 0.1, 1 또는 5 mg/ml) 25 ㎕를 비만세포 부유액에 투여한 10분 후에 HEPES-Tyrode 완충용액 25 ㎕를 첨가하여 반응시켰다. 또한 SMT의 compound 48/80 용액에 의한 histamine 유리 억제작용을 알아보기 위하여 비만세포 부유액에 상기 농도의 SMT 25 ㎕을 전처리 한 10분 후 역시 compound 48/80 (0.
- 0 ㎍/ml)을 100㎕씩 분주하여 coating 하였다 (TNF-a : RT, overnight IL-6, IL-8 : 4℃, overnight). Well plate를 0.05% Tween-20이 포함된 PBS로 washing 한 후 1% BSA, 5% sucrose, 0.05% NaN3가 포함된 PBS 180 ㎕를 첨가하여 1시간 동안 Blocking 하였다. SMT sample과 TNF-a, IL-6, IL-8의 standards 100 ㎕을 첨가 한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
- 75 g의 추출물을 얻었다. in vitro 실험의 경우 검액 (SMT)을 saline에 다양한 농도 (0.1, 1 또는 5 mg/ml)로 희석하여 사용하였으며, in vivo 실험의 경우에는 실험동물 체중 100 g당 14.91 mg을 1 ml의 증류수에 녹여 구강 투여하였다.
- 1, 1 또는 5 mg/ml) 25 ㎕를 비만세포 부유액에 투여한 10분 후에 HEPES-Tyrode 완충용액 25 ㎕를 첨가하여 반응시켰다. 또한 SMT의 compound 48/80 용액에 의한 histamine 유리 억제작용을 알아보기 위하여 비만세포 부유액에 상기 농도의 SMT 25 ㎕을 전처리 한 10분 후 역시 compound 48/80 (0.5 ㎍/ml) 25 ㎕을 첨가하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후 4℃에서 3000 rpm으루 원심분리 하여 상층액 내의 histamine 양을 Enzyme Immunoassay for Histamine kit (Oxford, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 비만세포의 형태가 원형 또는 난원형으로 세포윤곽이 뚜렷하고 세포질 내에 광굴절이 높은 과립들로 충만된 상태를 정상형 비만세포로 구분하였다. 반면에 세포윤곽이 불분명하고 세포질내 과립들이 세포 표면으로 돌출되거나 세포 주위에 흩어져 있는 경우를 탈과립형으로 구분하여 그 수를 실험군 당 임의로 선택한 5시야에서 계수하고, 탈과립율을 계산하였다.
- 복강비만세포의 직경은 대략 10-20 ㎛ 정도로 복강 부유액의 다른 세포들 (림프구 또는 호중성백혈구)에 비해 2배 이상 컸다. 비만세포의 형태가 원형 또는 난원형으로 세포윤곽이 뚜렷하고 세포질 내에 광굴절이 높은 과립들로 충만된 상태를 정상형 비만세포로 구분하였다. 반면에 세포윤곽이 불분명하고 세포질내 과립들이 세포 표면으로 돌출되거나 세포 주위에 흩어져 있는 경우를 탈과립형으로 구분하여 그 수를 실험군 당 임의로 선택한 5시야에서 계수하고, 탈과립율을 계산하였다.
- 사물탕 (SMT)이 알러지 염증 반응에 미치는 영향을 알아보기 위하여 in vitro에서 비만세포 활성화시 분비되는 히스타민 유리와 cytokine (IL-6, IL-8, TNF-a) 분비에 미치는 영향을 관찰하였고 in vivo에서 anti-IgE에 의한 혈관투과성을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 반응이 끝난 후 13, 000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 MTT solution을조심스럽게 제거한 다음 각 well에 500 ㎕의 DMSO 를 첨가하여 15-20분 정도 plate shaker로 흔들어 주었다. 살아있는 세포에 의해 생성된 보라색 formazan의 검출은 ELISA reader 를 사용하여 wave length 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 위상차 도립 현미경 상으로 비만세포의 형태를 관찰하기 위하여 반응이 끝난 비만세포 부유액 200 ㎕중 50 ㎕를 위상차 도립현미경 재물대 위에 놓여진 슬라이드글라스 (slide glass, 22x60 mm)위에떨어뜨려 비만세포들이 침전될 수 있도록 실온에서 5 분 동안 정지시켰다. 1,000배의 배율 하에서 비만세포를 위상차 도립현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 그리고 파란색 반점이 나타난 주사부위의 피부를 절취하여 3-4 mm정도의 작은 조각으로 세절하고 5 ml의 formamide 용액에 넣어 40 ℃ oven에서 24시간 (overnight) 동안 Evans blue 용액을유출시켰다. 유출시킨 Evans blue density을 spectrophtometer (backman instruments Incz DU530, USA)로 620 nm에서 측정한 후 Evans blue 표준곡선에 준하여 농도를 산출하였다.
- ㎕를 취하였다. 정상 비만세포에서 유리되는 histamine 양을 측정하기 위하여 비만세포 부유액 200 ㎕에 HEPES-Tyrode 완충용액 25 ㎕를 처리하였고, compound 48/80 용액에 의한 histamine 유리율을 측정하기 위하여 HEPES-Tyrode 완충용액 25㎕를 처리한 10분 후에 compound 48/80 (최종농도 : 0.5 ㎍ /ml) 25 ㎕을 첨가하여 반응시켰다. SMT가 단독으로 비만세포의 histamine 을 유리시키는지 알아보기 위하여 SMT (최종농도 : 0.
- 5 ㎍ (50 ㎕)을 주입하였다. 주사한 48시간 후에 DNP-human serum albumin 100 ㎍(100 ㎕)을 포함하는 4% Evans blue (1:4) 를 음경등 쪽정맥 내로 주입하였다. DNP-HSA로 감작 (challenge) 시키기 1시간 전에 SMT 14.
- 얻었다. 흰쥐를 에테르로 치사시킨 후 약 10 ml 의 HEPES-Tyrode buffer (완충용액)을 흰쥐의 복강 내에 주입하고 90초간 복벽을 가볍게 맛사지 하였다. 복벽 중앙선을 절개하고 복강 세척액을 스포이드로 채취하여 800 rpm에서 10분 동안 원심분리 시킨 후 상층액을 버리고, 동일 HEPES-Tyrode 완충용액으로 비만세포수가 1×106 cells/ml이 되도록 복강 부유액을 만들어 실험에 이용하였다.
대상 데이터
- Human mast cell line (HMC-1 Cell)은 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin, 100 ㎍/ml streptomycinO] 포함된 IscoveP Modified Dulbecco's Medium (IMDM)를 배양액으로 CO2 incubator (5% CO2, 37℃)에서 배양하였고, 배양액은 2-3일 간격으로 교환해주었다. HMC-1 Cells (3xl05 cells/500 ㎕)를 24 well plate 에 분주하고 CO2 incubator (5% CO2, 37℃)에서 30분 정도 안정화 시킨 후 SMT (0.
- 본 실험에 사용된 약물은 四物湯 (SMT)으로 그 구성은 아래의 Table 1과 같다. 사물탕 285 g을 3 L 둥근 플라스크에 넣고 2, 850 ml의 증류수를 가하여 냉각기가 부착된 전탕기에서 2시간 동안 가열한 후 여과지로 여과하였다.
- 실험동물은 샘타코 (주)에서 구입한 체중 200-300 g의 Sprague-Dawley (SD)계 수컷 흰쥐를 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 먹도록 하였으며, 사육실의 온도는 21-23℃, 습도는 40- 60%로 유지하였고, 낮과 밤의 주기는 각각 12시간으로 하였다.
데이터처리
- 실험결과는 통계 프로그램 SPSS® for windows (version 10.0, SPSS, Inc., Chicago, USA.)를 사용하여 약물의 농도에 따른 지표의 발현수치를 비교할 경우 oneway ANOVA를 실시하였으며, 유의수준 P value<005인 경우 유의성이 있다고 평가하였고 post hoc test로서 Scheffe's test를 시행하였다.
이론/모형
- TNF-a, IL-6z IL-8 의 정량은 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay 을 이용하여 측정하였다. 96-well ELISA plate (Nunc, Denmark)에 각각의 anti-human TNF-a, IL-6, IL.
- 세포독성을 알아보기 위하여 MTT colorimetric assay를 실행하였으며, 그 방법12)은 다음과 같다. HMC-1 Cells (3xl05 cells/500 ㎕)를 24 well plate 에 분주하고 CO2 incubator (5% CO2 37℃)에서 30분 정도 안정화 시킨 후 SMT (0.
성능/효과
- Compound 48/80 에 의한 흰쥐 복강 비만세포의 탈과립은수분이내에 관찰 되었고, 이러한 비만세포 탈과립율은 사물탕 추출물 전처리로 억제되었으며, 또한 compound 48/80 에 의한 흰쥐 복강 비만세포로 부터의 히스타민 유리율이 사물탕 추출물 전처리로 유의하게 억제되었다.
- 06 ㎍ 이었다. Compound 48/80용액에 의한 비만세포로부터의 histamine 유리가 SMT 추출물에 의하여 농도 의존적으로 억제되었으며 특히 SMT 1 및 5 mg/ml 에서는 현저한 histamine 유리 억제를 관찰할 수 있었다 (Fig. 3).
- Human Mast Cell line (HMC-1 Cel1) 에서 PMA plus A23187 의해 증가되었던 IL-6, IL-8, TNF-a의 분비가 사물탕 주출물 전처리로 유의하게 억제 되었다.
- 최근에 IL-8 은 단핵구나 대식세포에서 뿐만 아니라 사람 비만세포에서도 생성 된다고 보고 되었으며33), IL-8에 의해 생성된 염증세포 (neutrophils, macrophage, T lymphocytes)는 아토피 피부염 환자들에서도 발견되었다34). IL-8 생산에 미치는 영향을 관찰하기 위해 in vitro 실험을 진행한 결과 HMC-1 Cell 을 PMA plus A23187 로 stimulation 한 control 군에서는 IL-8 분비가 현저하게 증가되었고, 사물탕 추출물 전처리로 인하여 PMA plus A23187 로 유발된 IL-8의 분비가 유의하게 억제되었다.
- PMA plus A23187로 stimulation 한 대조군의 IL-6 분비는 0.44±0.02 ng/ml 으로 정상세포군의 0.08±0.01 ng/ml 비해 현저히 증가되었음을 보였다 SMT 추출물 (0.1,1,5 mg/ml)로 전처리 한 후 PMA plus A23187로 stimulation 한 실험군 에서는 SMT 추출물의 최종농도가 0.1,1,5 mg/ml 에서 각각 0.37±0.02 ng/ml, 0.42±0.01 ng/ml, 0.11±0.02 ng/ml 으로 PMA plus A23187 에 의한 HMC-1 Cells 에서의 IL-6 분비가 SMT 추출물에 의하여 유의하게 (0.1,1,5 mg/ml P<0.001) 억제되었음을 알 수 있었다 (Fig. 7A).
- 2). SMT 전처리에 의하여 compound 48/80용액에 의한 비만세포 탈과립이 현저히 억제됨을 알 수 있었다.
- SMT 추출물 (0.1, 1 또는 5 mg/ml)을 정상비만세포 부유액에 첨가하였을 때 비만세포의 형태, 크기, 표면윤곽 등이 정상 비만세포와 별다른 소견을 보이지 않았으며, 첨가 후 30분 동안 탈과립 현상은 보이지 않았다 (Fig. 1B, 1D). 이때 비만세포의 탈과립율은 각각 8.
- 00 ng/ml 비해 현저히 증가되었음을 보였다. SMT 추출물 (0.1,1,5 mg/ml) 로전처리 한 후 PMA plus A23187로 stimulation 한 실험군 에서는 SMT 추출물의 최종농도가 0.1,1,5 mg/ml 에서 각각 0.61±0.05 ng/ml, 0.30±0.03 ng/ml, 0.27±0.04 ng/ml 으로 PMA plus A23187 에 의한 HMC-1 Cells 에서의 TNF-a 분비가 SMT 주출물에 의하여 유의하게 (0.1 mg/ml P<0.05 1 및 5 mg/ml, P<0.001) 억제되었음을 알 수 있었다 (Fig. 7B).
- 00 ng/ml 비해 현저히 증가되었음을 보였다. SMT 추출물 (0.1,1, 5 mg/ml)로 전처리 한 후 PMA plus A23187로 stimulation 한 실험군 에서는 SMT 추출물의 최종농도가 0.1,1,5 mg/ml에서 각각 7.41±0.58 ng/ml, 7.40±0.55 ng/ml, 6.75±0.50 ng/ml 으로 PMA plus A23187 에 의한 HMC-1 cells 에서의 IL-8 분비는 SMT 추출물에 의하여 유의하게 (0.1 mg/ml P<0.05 1 mg/ml P<0.01, 5 mg/ml P<0.001) 억제되었다 (Fig. 7C).
- 를 활성화 시킨다. 그결과 세포 내 골격 및 세포 내 이동에 관여하는 미세소관과 미세섬유가 활성화되어 비만세포의 과립을 세포막 가까이로 이동시켜 결과적으로 세포막 융합을 일으키게 됨으로써 비만세포 탈과립 및 히스타민 유리현상이 일어난다고 알려졌다,
- 또한 사물탕은 in vivo 실험에서 anti-DNP IgE에 의한 피부 반응 (PCA)을 억제 하였는데, 이는 사물탕 추출물이 복강 비만세포의 탈과립과 히스타민 유리를 억제한 결과로 미루어 구강 내로 투여한 사물탕 추출물이 비만세포를 안정화 시킨 뒤에 투여된 anti-DNP IgE에 의한 혈관 투과성을 억제하여 Evans blue의 혈관 밖으로의 유출을 방지함으로써 진피내로의 파란색 반점의 출현을 억제한 것으로 생각된다. 그러나 아직까지 진피내로 투여된 anti-DNP IgE가 비만세포를 제외한 결합조직내의 여러 가지 세포들에 어떠한 영향을 주는 지에 대한 연구도 미비한 실정이어서 정확한 억제기전을 밝히기 위해서는 이 부분에 대한 연구도 보강되어야 할 것으로 생각된다.
- 001)을 보였다. 또한 산출된 Evans blue 농도가 4914.8±732, 0 ㎕/ml으로 control 보다 현저하게 혈관투과성이 억제되었다 (Table 2, Fig. 4, Fig. 5).
- 본 실험 결과 사물탕 추출물은 저농도와 고농도 (0.1,1,5 mg/ ml) 모두에서 세포독성이 나타나지 않았으며, PMA plus A23187 유발에 의해 증가 된 IL-6, TNF-a, IL-8의 분비를 모두 현저히 억제하였다.
- 1E). 비만세포의 탈과립율을 산출한 결과 98.0%로 탈과립된 비만세포는 현저하게 증가하였다 (Fig. 2).
- 1A). 위상차 도립현미경 유침 하에서 비만세포를 정상형과 탈과립형으로 구분하여 산출한 결과, 정상형의 비만세포는 94.0% 였으며 탈과립 된 비만세포는 6.0%로 대부분의 비만세포가 정상이었다 (Fig. 2).
- 이번 연구 결과 사물탕은 compound 48/80에 의한 흰쥐 비만세포의 탈과립을 억제하였으며, 또한 흰쥐 복강 비만세포의 히스타민 유리를 측정한 결과, compound 48/80에 의한 히스타민 유리율이 사물탕 추출물 전처리에 의해서 현저히 억제 되었음을 관찰할 수 있었다.
- 또한 IL-6는 IL-1, PDGF 및 TNF-a 등 성장인자의 자극이나 박테리아, 바이러스 감염에 의하여 생성되기도 한다28). 이번 연구에서는 사물탕 추출물이 IL-6 생산에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 in vitro 실험을 진행한 결과 HMC-l Cell 을 PMA plus A23187 로 stimulation 한 control 군에서 IL-6의 분비가 현저하게 증가되었고, 사물탕 추출물 전처리로 인하여 PMA plus A23187 로 유발된 IL-6의 분비가 유의하게 억제되었다.
- 특히 비만세포에서 유리된 TNF-a는 국소의 혈관내피세포에 작용하여 ELAM-1의 발현 및 백혈구의 혈관외 유주를 유도하는 것으로써 특히 알러지 국소의 염증반응에 중요한 역할을 하고있다26). 이번 연구에서는 사물탕 추출물이 TNF-a 생산에 미치는 영향을 관찰하기 위해 in vitro 실험을 진행한 결과 HMC-1 Cell 을 PMA plus A23187 로 stimulation 한 control 군에서는 TNF-a 분비가 현저하게 증가되었고, 사물탕 추출물 전처리로 인하여 PMA plus A23187 로 유발된 TNF-a의 분비가 유의하게 억제되었다. 따라서 사물탕 추출물이 TNF-q의 발현을 억제하여 염증을 억제하는 기전을 가지고 있음을 알 수 있다.
- 이상의 결과로 미루어 사물탕이 항알러지 및 항염증성 물질을 함유하고 있다고 생각된다.
- 이상의 결과로 사물탕 추출물은 compound 48/80 및 PMA plus A23187 에 의한 비만세포 활성화와 혈관투과성을 억제하는 항 알러지 염증효과가 있는 것으로 사료된다.
- 이상의 형태적인 결과로 탈과립율을 계산해 본 결과 SMT 추출물을 전처리 한 후 compound 48/80용액을 처리한 비만세포의 탈과립율은 SMT 추출물의 최종농도가 0.1 mg/ml 일 때 90.0%, 1 mg/ml 일 때 54.0%, 5 mg/mP길 때 14.0% 이었다 (Fig. 2). SMT 전처리에 의하여 compound 48/80용액에 의한 비만세포 탈과립이 현저히 억제됨을 알 수 있었다.
- 혈관투과성의 증가에 사물탕이 미치는 영향을 알아보기 위한 in vivo 실험결과, 흰쥐 피부에 antiAgE에 의한 피부반응 (PCA 반응) 유도시 증가된 혈관 투과성이 사물탕 추출물 전처리로 현저하게 억제되었다.
후속연구
- 억제한 것으로 생각된다. 그러나 아직까지 진피내로 투여된 anti-DNP IgE가 비만세포를 제외한 결합조직내의 여러 가지 세포들에 어떠한 영향을 주는 지에 대한 연구도 미비한 실정이어서 정확한 억제기전을 밝히기 위해서는 이 부분에 대한 연구도 보강되어야 할 것으로 생각된다.
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