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제안 방법
- 본 연구에서는 타원법을 이용하여 생체 물질을 in vitro 환경에서 실시간으로 측정, 분석하는 기법을 확립하고, 인간의 성체 줄기세포 중 중간엽 줄기세포에 이 기법을 최초로 적용하였다. 중간엽 줄기세포를 유리기판 위에 배양하고 in vitro 환경에서 줄기세포의 핵 영역과 세포체 영역으로 구분하여 각각의 영역에서 두께와 광학적 물성을 결정하였다.
- 본 연구에서는 타원법을 이용하여 생체 물질을 in vitro 환경에서 실시간으로 측정, 분석하는 기법을 확립하고, 인간의 성체 줄기세포 중 중간엽 줄기세포에 이 기법을 최초로 적용하였다. 중간엽 줄기세포를 유리기판 위에 배양하고 in vitro 환경에서 줄기세포의 핵 영역과 세포체 영역으로 구분하여 각각의 영역에서 두께와 광학적 물성을 결정하였다. 이미 언급한 바와 같이 기존의 광학현미경을 사용하여서는 이러한 중간엽 줄기세포의 두께정보를 얻을 수 없었고 이에 따라 부피에 대한 정량적인 평가를 내릴 수 없는 한계를 보여 왔기에 본 연구에서 제시하는 방법은 세포가 분화하거나 외부 자극을 받았을 때 나타나는 변화를 정량적으로 확인하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
- 굴절률이 n0인 매질(0)과 굴절률이 n1인 박막(1) 그리고 기층(2)의 굴절률(n2)을 모두 알고 있는 3상계 시료의 경우 미지상수인 박막의 두께 d는 ρ = tanψ·eiΔ으로 정의되는 타원상수 ρ를 사용하여 다음과 같이 수치해석적인 방법으로 구한다.
- 영상타원계를 사용하여 구한 타원상수 Δ, ψ의 영상정보는 수치해석적 역방계산 방법을 사용하여 구성물질의 광학상수 즉 줄기세포의 굴절률과 두께의 영상정보로 변환시켰다.
- 줄기세포는 기판 위에서 배양되면 얇은 막처럼 비교적 균일한 두께를 가진다. 본 연구에서는 일반적으로 culture plate에 세포를 배양하는 방법과 동일한 방법으로, 즉, 금속 박막이 코팅되어 있지 않은 유리기판 위에 바로 세포를 배양하였다. 이로써 세포가 배양되는 정도를 광학현미경으로 바로 확인할 수 있었으며 코팅 등 특별한 공정이 포함되지 않아 세포의 공급을 훨씬 더 용이하게 할 수 있었다.
- 줄기세포를 배양할 때 culture plate 상에서 자라나는 세포들이 일정한 두께를 가지지는 않지만 많은 반복 실험을 통해 세포의 두께가 평균적인 수치값에서 일정 범위내의 분포를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 세포는 유연하고 주위 환경에 적응하여 모양의 변형이 가능한 lipid의 membrane을 가지고 있기에 물리적으로 접히거나 하지 않지만 반사 현미경을 통해 세포의 변형여부를 판별하고 morphology상 이상이 없는 세포들을 대상으로 영상타원상수를 구하였다.
- 인간 중간엽 줄기세포를 세포핵과 세포체의 두 영역으로 나눌 수 있다. 그림 2에서 인간 중간엽 줄기세포의 핵(그림 2-a-①)과 세포체(그림 2-b-②)의 영역을 선별하여 in vitro 환경을 유지하면서 각각 선별된 부분의 타원상수를 측정하고 분석하였다. 핵 영역에서 측정한 타원상수의 맵 데이터(그림 3-a, b)를 수치해석적 역방계산하여 구한 굴절률 분포도와 두께분포도(그림 3-c, d) 그리고 세포체 영역에서 측정한 타원상수의 맵 데이터(그림 4-a, b)와 이를 역방계산하여 구한 굴절률 분포도와 두께분포도(그림 4-c, d)는 다음과 같다.
- 영상타원법을 이용하여 인간 중간엽 줄기세포의 두께와 광학적 물성을 세계 최초로 구하였다. 영상 타원계를 이용하여 생체 완충용액의 미분화된 인간 중간엽 줄기세포를 대상으로 in vitro 환경에서 실시간으로 타원상수 Δ, ψ의 2차원 데이터를 얻었다.
- 영상 타원계를 이용하여 생체 완충용액의 미분화된 인간 중간엽 줄기세포를 대상으로 in vitro 환경에서 실시간으로 타원상수 Δ, ψ의 2차원 데이터를 얻었다. 핵과 세포체의 영역을 각각 선택하여 수치해석적 역방계산을 통해 줄기세포의 굴절률과 두께를 결정하였다. 세포핵의 굴절률은 1.
대상 데이터
- 인간 중간엽 줄기세포 시료는 다음과 같이 준비하였다. 아주대 병원 환자에게로부터 골수 유래 인간 중간엽 줄기세포를 기증받아 이를 10% 소혈청과 1% 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하는 저혈당 세포배양 배지 디엠이엠에서 배양하였다. 배양기 온도는 37℃를 유지하였고 5%의 CO2를 지속적으로 공급해 주었다.
- 1% 이디티에이를 37℃에서 3분간 처리하여 세포들을 떼어 낸 후 새로운 세포 배양 접시에 옮겨 계대 배양을 하였다. 본 연구에서는 6번의 계대 배양을 거친 인간 중간엽 줄기세포를 타원법 측정에 사용하였다.
- 사용된 유리의 재질은 무반사코팅이 된 BK7 유리이며, 유리를 수직으로 입사하는 빛이 시료면에 입사하는 각도는 60°이다.
- 영상타원 정보는 PSCA구조의 영상타원계인 나노필름(NANO-film)사의 EP3를 이용하여 얻었다. 이 영상타원계는 532 nm의 단색광을 광원으로 사용하며 배율이 10 배인 대물렌즈 또는 배율이 20 배인 고배율 대물렌즈를 사용함으로써 1.
- 영상타원계를 사용하여 구한 타원상수 Δ, ψ의 영상정보는 수치해석적 역방계산 방법을 사용하여 구성물질의 광학상수 즉 줄기세포의 굴절률과 두께의 영상정보로 변환시켰다. 본 실험에서 사용된 시료들은 유리기층 위에 성체 줄기세포가 있는 시료들로써 매질/박막/기층으로 구성되는 3상계 광학모형으로 근사될 수 있다. 굴절률이 n0인 매질(0)과 굴절률이 n1인 박막(1) 그리고 기층(2)의 굴절률(n2)을 모두 알고 있는 3상계 시료의 경우 미지상수인 박막의 두께 d는 ρ = tanψ·eiΔ으로 정의되는 타원상수 ρ를 사용하여 다음과 같이 수치해석적인 방법으로 구한다.
- 시료의 광학구조는 3상계로 근사하였는데 매질인 생체 완충용액(PBS)의 굴절률은 1.3337으로 하였고 유리기판인 기층의 굴절률은 1.5261으로 하였다. 완충용액의 온도는 일정하게 유지시켰기 때문에 굴절률의 온도의존성은 고려하지 않았다.
- 영상 타원계를 이용하여 생체 완충용액의 미분화된 인간 중간엽 줄기세포를 대상으로 in vitro 환경에서 실시간으로 타원상수 Δ, ψ의 2차원 데이터를 얻었다.
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