[논문]노화촉진마우스의 텔로미어 함량 분석

이미랑; 도경탁; 한정주; 문소현; 강한석; 김선구; 신택순; 이홍구; 황대연; 김용균; 손시환; 최나은; 김병우; 조병욱

doi:10.5352/jls.2009.19.10.1463

노화촉진마우스의 텔로미어 함량 분석
Amount of Telomeric DNA on Lymphocytes in Senescence Mouse by Quantitative Fluorescence in situ Hybridization 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.19 no.10 = no.114, 2009년, pp.1463 - 1467

Abstract ▼ AI-Helper

Telomeres, comprised of tandem repeats of TTAGGG sequences, are special nucleoprotein structures that protect and stabilize chromosome ends. These structures form the crux of the telomere concept of aging, senescence and genomic instability. The classic terminal restriction fragment (TRF) analysis to quantify the amount of telomeric DNA is disadvantageous in species containing ultra long telomeres like in mice (100Kb). In this study, we used a more sensitive quantitative fluorescence in situ hybridization (Q FISH) technique to quantify telomeric DNA, and used it as a biological aging marker in mice. 12 litters each of Senescence-Resistant (SAMR1) and -Prone (SAMP1) known as senescence accelerated mouse strains were purchased from Central Lab, Animal Inc. We quantified the amount of telomeric DNA using telomere specific DNA probes on the two strains of male mice at 8 weeks, 18 weeks and 26 weeks of age. The amount of telomeric DNA correlated with aging and age associated changes in body and organ weight between SAMR1 and SAMP1 strains of mice. These data suggest the usefulness of the amount of telomeric DNA as a biological aging marker in human aging studies.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

거의 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 노화 촉진모델 마우스의 체 성장 양상을 살펴보고 또한 양적형광접합보인법을 이용하여 성장단계별 telomeric DNA 함유량을 분석함으로써 노화와의 연관성을 구명하고자 하였다.
본 실험은 SAMP1 마우스를 이용하여 노화의 진행 단계별 조직의 변화 양상을 살펴보고자 성장 단계별 체중 및 장기 무게를 즉정 조사하였다. 주령별 마우스의 체중과 증체량을 Table 1에 제시하였고, 이들의 변화양상을 Fig.

가설 설정

즉, 노화촉진 마우스로 육종된 SAMP1의 경우 26주령을 전 . 후로 대조군에 비해 노화가 급격히 진행되는 것으로 가정하고, 이러한 체중의 변화가 노화의 진행 지표임을 시사한다.

제안 방법

각 주령별 체중의 변화에 따른 장기들의 변화양상을 확인하기 위해 주령별 각 장기인 뇌, 심장, 폐, 위, 간, 비장, 췌장, 신장 및 정소를 적출하여 무게를 측정 조사하였다. 이상의 통계적 분석 결과로서 각 장기에서는 유의적 차이는 보이지 않았지만, 간(liver)의 경우 노화촉진마우스군이 대조군에 비해 26주령을 전후로 무게가 증가하는 양상을 확인할 수 있었다 (Fig.
결론적으로 노화촉진 모델로 알려진 SAMP1 마우스는 성장이 진행됨에 따라 대조군인 SAMR1과 비교하여 26주를 전 . 후로 비교적 빠른 성장 후 급격히 성장 속도가 지연되는 것을 확인하였고, SAMP1 마우스의 백혈구 세포내의 텔로미어 함량분석 결과 동 시기에 급격한 텔로미어의 감소 양상을 나타냄으로 본 시점부터 생리적 노화 현상이 급격히 진행되는 것으로 생각된다.
마우스의 성장단계별 텔로미어 함량을 분석하기 위해 혈액을 이용한 표본 제작을 수행하고, telomeric DNA probe로서 FISH를 수행한 후 이미지 분석 프로그램(image analyzer program; MetaMorph®)을 이용하여 8, 18 및 26주령 텔로미어의 상대적 함량을 분석하였다. 주령별 간기 핵 내 대표적인 텔로미어의 분포양상을 Fig.
5℃에서 30분간 반응시키고 PN buffer로 세척한 후 암소에서 건조시켰다. 배경염색은 propidium iodide solution (PI; Sigma-Aldrich) 을 이용하였으며 형광 접합 발현 양상은 PI와 FITC 파장대의 겸용 필터를 부착한 형광현미경(Model AX-70 with WIB filter, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
본 연구에서 수행한 형광접합보인법 (fluorescence in situ hybridization; FISH)은 먼저 슬라이드 표본을 RNase (Sigma- Aldrich) 처리 후 Hybridization 용액(13 μ1 formamide, 5 μ1 hybridization buffer, 2 μ1 (100 ng/ gl, human telomeric DNA probe; Roche)을 떨어뜨리고 72℃에서 5분간 변성(denaturation) 하고 38.5℃에서 12시간 접합(hybridization)시켰다. 접합 후 슬라이드를 2x SSC로서 72℃에서 5분간 처 리하고 PN buffer (0.
실험군(SAMP1 계통)과 대조군(SAMR1 계통)의 백혈구 세포 표본의 제작은 실험구별 각 3마리 의 심장으로부터 약 500 μ1의 혈액을 채취하여 백혈구만 순수 분리하였고, 이러한 혈액 세포들은 0.06 M KC₁ 용액을 이용하여 실온에서 15분간 저장 처리하였다. 저장처리가 끝나면 혼합된 고정액(3 methanol : 1 acetic acid )을 10방울정도 첨가한 후 원심분리 시키고, 상기고정액을 이용하여 2회 반복 처리 후 슬라이드 표본을 제작하였다.
06 M KC₁ 용액을 이용하여 실온에서 15분간 저장 처리하였다. 저장처리가 끝나면 혼합된 고정액(3 methanol : 1 acetic acid )을 10방울정도 첨가한 후 원심분리 시키고, 상기고정액을 이용하여 2회 반복 처리 후 슬라이드 표본을 제작하였다.
처리된 슬라이드를 형광현미경으로 관찰한 후 100배의 대물렌즈 하에서 평균 5개의 간기 핵을 한 프레임으로 촬영하고 개체 당 최소 100개 이상의 세포에 대하여 이미지 분석 프로그램 (Image analyzer program, MetaMorph, UIC, Pennsylvania, USA) 을 이용하여 핵 대비 telomeric DNA 분포량을 계산하였다.
구입 공시하였다 ((주중앙실험동물, 대전). 첫 1~2 주간사육실 환경 적응을 시킨 뒤 specific pathogen free (SPF) 상태에서 온도 23±1℃, 습도 40~60%에서 사육하였고, 체중증가량과 사료 및 음수섭취량은 매주 수요일 오전 10시에 측정하였다. 모든 실험은 부산대학교 실험동물운영위원회(IACUC) 의 승인을 받아 본 위원회의 관리 지침에 준하여 수행하였다.
텔로미어 접합 특이 probe 제작을 위하여 (CCCTAA) 7으로구성된 42mers 단일 oligomers를 primer로 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하고, 증폭된 산물을 PCR-DIG Probe Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Germany) 를 이용하여 digoxigenin labeling을 하였다.

대상 데이터

노화촉진모델 마우스의 성장 단계별 체중 및 장기의 변화 그리고 텔로미어의 양적 분석을 위해 Senescence-Resistant (SAMR1) 계통과 Senescence-Prone (SAMP1) 계통 수컷 각 12 마리씩 구입 공시하였다 ((주중앙실험동물, 대전). 첫 1~2 주간사육실 환경 적응을 시킨 뒤 specific pathogen free (SPF) 상태에서 온도 23±1℃, 습도 40~60%에서 사육하였고, 체중증가량과 사료 및 음수섭취량은 매주 수요일 오전 10시에 측정하였다.
본 실험에 이용된 Senescence Accelerated Mouse (SAM) 는노화촉진모델마우스로 인간의 노화 연구에 활용할 수 있는 최적의 포유 동물모델로 간주되고 있다. SAM mouse는 탈모, 피모광택 감퇴, 안구 주위 병변, 백내장, 척추만곡 증가, 면역반응 저하 및 수명단축과 같은 노화의 생리적 특징을 나타내며, 노화현상이 4~6개월령부터 관찰되고, 11~12개월령에는 극심한 노화 현상을 보이며 사망에 이르는 것으로 보고되고 있다 [9, 17].
장기채취는 실험군별 각 3마리씩을 8, 18, 26주령 그리고 30주령에 채취하였다. 마우스를 개복한 후 뇌, 폐, 심장, 간, 위, 신장, 비장, 췌장, 정소를 떼어내고 각 장기들의 무게를 측정한 후 -79℃ 냉동고에 보관하였다.

데이터처리

노화촉진 마우스의 성장 단계별 조직 및 체중의 변화량과 세포 내 텔로미어 함량을 비교 분석하기 위하여 SAS 통계 패키지(ver, 11.0, USA)를 이용하였고, 성장 단계별 조직 및 체중의 변화량은 T-test, 텔로미어 함량 분석은 GLM/Duncan 법에의해 p<0.05의 유의 수준에서 유의성 검증을 수행하였다.

성능/효과

성장 단계별 체중의 변화 양상을 살펴보면 대조군인 SAMR1 의 경우 26주까지 일정한 속도로 체중이 증가하는 반면 SAMP1은 대조군에 비해 성장 초기부터 비교적 빠른 증가 현상을 나타내었고, 26주령을 전후로 유의적인 체중 감소 현상이 관찰되었다. 두 실험군의 증체량을 분석한 결과 노화 촉진 마우스인 SAMP1의 경우 대조군에 비해 비교적 높게 나타났으며, 26주령을 전후로 대조군에 비해 빠른 속도로 감소하는 양상 역시 확인할 수 있었지만 유의적인 통계치는 관찰되지 않았다. 또한 사료섭취량과 음수량에 있어서 두 그룹 간 차이는 보이지 않아 실험 결과에서 제외시켰다.
3에 제시하였다. 분석 결과 노화 촉진계통(SAMP1) 및 노화억제계통(SAMR1) 모두에서 주령 이 증가함에 따라 텔로미어 함량이 점진적으로 감소하는 것이 관찰 되 었으며, 모든 주령 에서 SAMP1 이 SAMR1에 비해 낮은 텔로미어 함유율을 보였다(Table 2). 특히, SAMP1의 경우 텔로미어 함량이 26주령에 유의적으로 급격히 감소되는 양상을 보임에 따라 앞서 체중의 변화양상과 더불어 이 시점이 노화의개시점으로 사료된다(Fig.
1에 나타내었다. 성장 단계별 체중의 변화 양상을 살펴보면 대조군인 SAMR1 의 경우 26주까지 일정한 속도로 체중이 증가하는 반면 SAMP1은 대조군에 비해 성장 초기부터 비교적 빠른 증가 현상을 나타내었고, 26주령을 전후로 유의적인 체중 감소 현상이 관찰되었다. 두 실험군의 증체량을 분석한 결과 노화 촉진 마우스인 SAMP1의 경우 대조군에 비해 비교적 높게 나타났으며, 26주령을 전후로 대조군에 비해 빠른 속도로 감소하는 양상 역시 확인할 수 있었지만 유의적인 통계치는 관찰되지 않았다.
염색체말단구조의 상실이 세포노화와 관련이 있다는 최초의 실험적 증거는 인체 섬유아세포의 terminal restriction fragment (TRF)의 길이가 세포분열을 반복함에 따라 감소하고, 노인 세포의 텔로미어 길이가 어린이 세포의 그것보다 짧다는 점을 확인할 수 있었다. 즉, DNA 복제를 계속할 수록 텔로미어의 길이가 감소하며 일정 길이 이하로 줄어들면 결국 세포분열를 멈추고 세포노화가 시작된다는 점을 시사한바 있다[7].
및 정소를 적출하여 무게를 측정 조사하였다. 이상의 통계적 분석 결과로서 각 장기에서는 유의적 차이는 보이지 않았지만, 간(liver)의 경우 노화촉진마우스군이 대조군에 비해 26주령을 전후로 무게가 증가하는 양상을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). 노화의 진행이 다른 장기들의 무게 변화에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 판단은 어려운 것으로 사료되어 향후 30주령 이후 장기간에 걸친 조사와 조직별 유전자 발현양상의 분석이 요구되는 사항이다.
후로 비교적 빠른 성장 후 급격히 성장 속도가 지연되는 것을 확인하였고, SAMP1 마우스의 백혈구 세포내의 텔로미어 함량분석 결과 동 시기에 급격한 텔로미어의 감소 양상을 나타냄으로 본 시점부터 생리적 노화 현상이 급격히 진행되는 것으로 생각된다.

후속연구

따라서 마우스의 경우 텔로미어 함량분석법은 조직 및 기관의 세포에서 측정하는 것보다 비교적 텔로미어 길이가 일정하게 측정되는 백혈구 세포에서의 분석이 더 적합할 것이라 사료된다. 더불어 텔로미어 함유량이 연령과 높은 부의 상관성을 보이고, 노화 촉진계통에서 유의적으로 낮은 함유율을 보임으로서 텔로미 어가 노화와 직접적인 관련이 있는 훌륭한 생물학적 지표임을 다시 한번 입증하였고 형광접합보인법을 이용한 텔로미어의 상대적 함량 분석법이 마우스의 텔로미어 양상을 분석하는데 정확한 지표로서 매우 유용하게 활용될 수 있음을 제시한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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