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문제 정의
- 있다. 본 연구에서는 adipogenesis의 상위단계에 위치한 다양한 pro-adipogenic regulators와 anti-adipogenic regulators의 발현이 platycodin D에 의해 어떻게 변화되는지 분석하였다. Real-time PCR을 이용한 mRNA 발현의 정량적분석에서 adipogenesis의 marker라 불리는 ADIPOQ와 GLUT4의 mRNA 발현은 platycodin D의 처리 에 의해 유의 적으로 감소되었다.
- 2B의 결과는 7일간 분화시킨 지방세포에서 GLUT4의 mRNA 발현이 분화 전 세포에 비해 300배 이상 크게 증가하고 platycodin D의 처리에 의해 유의하게 감소함을 보여준다. 이러한 ADIPOQ와 GLUT4와 같은 terminal marker의 발현에 대한 platycodin D의 억제 결과는 platycodin D가 지방세포 형성을 저해한다는 본 연구진의 선행연구결과를 뒷받침한다.
- 4A, 4B). 이러한 결과는 platycodin D에 의한 anti-adipogenesis효과가 C/EBI와 C/EBP6에 비의존적으로 작용하여 PPARy와 C/EBPa의 발현을 조절함을 제시한다.
- 35]. 최근 본 연구진에 의해 3T3-L1의 분화억제 및 중성지방의 축적 저해에 대한 platycodin D의 효능이 규명되었다 [17], 본 연구에서는 3T3-L1 지방세포에서 platycodin D에 의한 adipogenesis억제의 분자적 메커니즘을 규명하기 위하여 adipogenesis의 조절에 관여하는 다양한 유전자의 발현을 분석하였다.
제안 방법
- 1 jig의 total RNA는 cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA)를 이용하여 역전사 하였다. Real-time PCRe 7000 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 장비를 사용하여 진행되었다.
- 될 때까지 배양하였다. 2일 후(day 0), 10% fetal bovine serum (FBS)을 포함한 DMEM에 1 |ig/ml insulin, 0.25 μM dexamethasone 그리고 0.5 mM 3-isobutyl-l-methylxan-thine이 첨가된 differentiation-induction medium (분화유도배지)로 교체하여 48시간 처리하였다. 그 후 2일 간격으로 10% FBS를 포함한 새 배지에 1 |ig/ml insulin이 첨가된 differentiation-maintenance medium (분화 유지 배지)로 교체되 었다.
- 그 후 2일 간격으로 10% FBS를 포함한 새 배지에 1 |ig/ml insulin이 첨가된 differentiation-maintenance medium (분화 유지 배지)로 교체되 었다. Adipogenesis의 진행과정에서 platycodin D의 영향을 확인하기 위해, 분화 유도 배지와 분화 유지 배지를 첨가할 때 platycodin D를 함께 처 리하였다.
- 그 중, 지방세포가 완전히 분화되 었을 때 높게 발현되는 ADIPOQ는 ADIPOQ 수용체(AdipoR)에 결합하여 에너지 대사와 인슐린 신호경로 (insulin pathway)를 조절한다고 알려져 있다[16]. Platycodin D가 terminal marker인 ADIPOQ의 mRNA 발현에 어떤 영 향을 주는지 살펴보기 위해, platycodin D를 배지에 첨가 혹은 첨가하지 않고 3T3-L1 세포를 7일 간 분화한 후 세포로부터 total RNA를 정 제하여 real-time PCR을 진행하였다. 그 결과, 분화된 세포에서 ADIPOQ 의 mRNA 발현이 전지방세포에 비해 28, 000 여 배 이상 증가하였고 platycodin D의 첨가에 의해 크게 감소하였다(Fig.
- 이와는 달리 C/EBPP, C/EBP5, KROX20 및 KLF (Kruppel-like factor)15 와 같은 pro-adipogenic regulators 은 전지방세포에서 억제되어 있다가 분화가 유도되면서 크게 증가하는 양상을 보인다. Platycodin D가 어떤 인자들을 조절하여 PPARy와 C/EBPa의 mRNA 발현을 억 제하는지 밝히 기 위해 두 유전자의 상위에 위치한 조절자들의 mRNA 발현을 살펴보았다. Fig.
- 또한 terminal marker의 발현을 조절하는 PPARy와 C/EPBa의 mRNA 발현 역시 platycodin D에 의해 유의하게 억제되었다. Platycodin D의 지방세포 억제 효과에 대한 상세한 분자적 메커니즘을 규명하기 위해, PPARy와 C/EPBa의 상위 조절자들의 mRNA 발현 변화를 분석하였다. Pro-adipogenic regulators에 대한 platycodin D의 효과를 분석한 결과, C/EBI와 C/EPB6의 mRNA 발현은 platycodin D에 의해 변화가 없었던 반면, KROX20과 KLF15의 mRNA 발현은 각각 초기 분화(2일)와 후기 분화(4일)에서 platycodin D에 의해 유의한 감소를 보였다.
- , Foster City, CA, USA)를 이용하여 역전사 하였다. Real-time PCRe 7000 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 장비를 사용하여 진행되었다. PCRe 다음의 조성으로 최종 반응 부피를 20 μ1로 준비하여 3반복 하였 匸TaqMan gene expression master mix, 250 nM TaqMan Probe, 2 μM의 각 primer, 2 μ1의 cDNA.
대상 데이터
- 배양하였다. Platycodin D (Fig. 1)는 서울대 학 약학대학소속의 공저자가 제공하였고 다른 시약들은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
- 적정 조성으로 혼합된 반응물질은 효소를 활성화시키기 위해 95℃에서 10분간 반응 시 킨 후, 95℃에서 15초와 60℃에서 1분으로 구성된 40 cycle 을 진행하였다. Real-Time PCR에 사용된 primer는 Applied Biosystems 사의 assay on demand gene expression 제품을 구매하여 사용하였다. Endogenous control는 Gustafson과 Smith를 참고로 18S rRNA를 사용하였다[8].
- 실험에 사용된 3T3-L1 세포 (preadipocyte)는 ATCC (American type culture collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 Dulbecco's modified Ease's medium (DMEM)에 10% calf serum, 100 |ig/mL streptomycin, and 100 units/ml penicillin 과 함께 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다. Platycodin D (Fig.
데이터처리
- )로 나타냈다. Platycodin D가 첨가된 군과 첨가되 지 않은 군, 두 군 사이의 비교에 대한 통계 의 유의 성은 unpaired t-test에 의해 검증되었다.
- 모든 실험 결과는 SPSS ver. 14.0 프로그램 (SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균(mean) ± 표준오차(S.E.)로 나타냈다. Platycodin D가 첨가된 군과 첨가되 지 않은 군, 두 군 사이의 비교에 대한 통계 의 유의 성은 unpaired t-test에 의해 검증되었다.
이론/모형
- Real-Time PCR에 사용된 primer는 Applied Biosystems 사의 assay on demand gene expression 제품을 구매하여 사용하였다. Endogenous control는 Gustafson과 Smith를 참고로 18S rRNA를 사용하였다[8]. 각 샘플에 대한 표적유전자의 mRNA 수준은 동일한 샘플 내의 18S rRNA에 의해 표준화되었고, 표준화 된 샘플들의 값은 전지방세포(day 0)의 값을 기준으로 Ct method에 의해 비교되었다[19].
- Total RNA는 acid-phenol 추출법을 이용한 RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제시 된 편람에 따라 분리 정제되었다. 추출된 total RNA는 분광광도계를 이용하여 optical density (OD) 값을 측정하고 역전사(reverse transcription) 반응을 진행할 때까지 -80℃에 보관하였다.
- Endogenous control는 Gustafson과 Smith를 참고로 18S rRNA를 사용하였다[8]. 각 샘플에 대한 표적유전자의 mRNA 수준은 동일한 샘플 내의 18S rRNA에 의해 표준화되었고, 표준화 된 샘플들의 값은 전지방세포(day 0)의 값을 기준으로 Ct method에 의해 비교되었다[19].
- 2A). 또한, 인슐린에 의해 조절되는 당수송(glucose transport) 등의 에너지 대사에서 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있는 또 다른 terminal marker인 GLUT4의 mRNA 발현의 변화도 본 연구에서 측정되었다[27]. Fig.
성능/효과
- Platycodin D의 지방세포 억제 효과에 대한 상세한 분자적 메커니즘을 규명하기 위해, PPARy와 C/EPBa의 상위 조절자들의 mRNA 발현 변화를 분석하였다. Pro-adipogenic regulators에 대한 platycodin D의 효과를 분석한 결과, C/EBI와 C/EPB6의 mRNA 발현은 platycodin D에 의해 변화가 없었던 반면, KROX20과 KLF15의 mRNA 발현은 각각 초기 분화(2일)와 후기 분화(4일)에서 platycodin D에 의해 유의한 감소를 보였다. 또한/ 대표적인 anti-adipogenic regulators인 CHOP의 mRNA 발현은 초기분화에서 platycodin D에 의해 유의하게 증가한 반면/ 또 다른 anti-adipogenic regulators인 C/EBPy의 mRNA 발현은 platycodin D 에 의해 영향을 받지 않았다.
- 본 연구에서는 adipogenesis의 상위단계에 위치한 다양한 pro-adipogenic regulators와 anti-adipogenic regulators의 발현이 platycodin D에 의해 어떻게 변화되는지 분석하였다. Real-time PCR을 이용한 mRNA 발현의 정량적분석에서 adipogenesis의 marker라 불리는 ADIPOQ와 GLUT4의 mRNA 발현은 platycodin D의 처리 에 의해 유의 적으로 감소되었다. 또한 terminal marker의 발현을 조절하는 PPARy와 C/EPBa의 mRNA 발현 역시 platycodin D에 의해 유의하게 억제되었다.
- 따라서 adipogenesis 과정에서 platycodin D는 pro-adipogenic reulators 인 KROX20, KLF15 와 anti-adipogenic reulator인 CHOP의 mRNA 발현에 영 향을 주어 PPARy와 C/EPBa를 조절하는 것으로 보여진다. 결론적으로, platycodin D에 의한 adipogenesis 억제 효과는 KROX20, KLF15 등의 pro-adipogenic regulator와 CHOP 등의 anti-adipogenic regulator의 상호작용을 통해 나타나는 결과라 사료된다.
- Platycodin D가 terminal marker인 ADIPOQ의 mRNA 발현에 어떤 영 향을 주는지 살펴보기 위해, platycodin D를 배지에 첨가 혹은 첨가하지 않고 3T3-L1 세포를 7일 간 분화한 후 세포로부터 total RNA를 정 제하여 real-time PCR을 진행하였다. 그 결과, 분화된 세포에서 ADIPOQ 의 mRNA 발현이 전지방세포에 비해 28, 000 여 배 이상 증가하였고 platycodin D의 첨가에 의해 크게 감소하였다(Fig. 2A). 또한, 인슐린에 의해 조절되는 당수송(glucose transport) 등의 에너지 대사에서 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있는 또 다른 terminal marker인 GLUT4의 mRNA 발현의 변화도 본 연구에서 측정되었다[27].
- 또한/ 대표적인 anti-adipogenic regulators인 CHOP의 mRNA 발현은 초기분화에서 platycodin D에 의해 유의하게 증가한 반면/ 또 다른 anti-adipogenic regulators인 C/EBPy의 mRNA 발현은 platycodin D 에 의해 영향을 받지 않았다. 따라서 adipogenesis 과정에서 platycodin D는 pro-adipogenic reulators 인 KROX20, KLF15 와 anti-adipogenic reulator인 CHOP의 mRNA 발현에 영 향을 주어 PPARy와 C/EPBa를 조절하는 것으로 보여진다. 결론적으로, platycodin D에 의한 adipogenesis 억제 효과는 KROX20, KLF15 등의 pro-adipogenic regulator와 CHOP 등의 anti-adipogenic regulator의 상호작용을 통해 나타나는 결과라 사료된다.
- 이러한 CHOP의 기능은 C/EBI의 mRNA 발현에 관여하기 보다는, C/EBPp 단백질의 활성을 억제하여 그 하위의 인자들을 조절하는 것으로 생각된다. 따라서 platycodin D에 의해 변화가 없었던 C/EBI의 결과(Fig. 4A)와 C/EBI의 하위에 위치한 PPARy 의 억제 결과(Fig. 3A)는 CHOP에 의한 C/EBPP 단백질의 활성 억 제 결과와 부합된다. Anti-adipogenic regulator인 CHOP 의 mRNA 발현은 분화 초기에 platycodin D의 처리에 의해증가됨으로써 platycodin D에 의한 adipogenesis 억제효과의 기전을 설명할 수 있다.
- 4의 결과들은 platycodin D가 유도하는 anti-adipo-genesis의 효과가 PPARy와 C/EBPa의 상위에 위 치하는 proadipogenic regulator에 의해 조절됨을 제시한다. 또한, 그 중에서도 C/EBI와 C/EBP5 보다는 KROX204 KLF15가 platycodin D의 첨가에 의해 각각 분화의 초기와 후기에 억제되어 platycodin D가 유도하는 adipogenesis 억 제 효과에 관여하는 것으로 보여진다.
- 본 연구를 통해 platycodin D의 adipogenensis 억제효과에 관여하는 여러 pro-adipogenic regulators과 anti-adipogenic regulators의 mRNA 발현 변화를 확인할 수 있었다. Platycodin D에 의해 변화된 KROX20, KLF15와 같은 pro-adipogenic regulators2]- CHOP과 같은 anti-adipogenic regulator는 주로 PPARy와 그 상호조절자인 C/EBPa의 mRNA 발현을 억제함으로써 ADIPOQ나 GLUT4의 발현을 감소시켜 결국 adipogenesis를 저해하는 것으로 생각된다(Fig.
- C/EBP 계열에 속하는 C/EBPy와 CHOPe C/EBP 6의 싱위에서 C/EBI를 조절하여 adipogenesis에 관여한다고 보고되고 있다[5]. 본 연구에서 C/EBPy의 mRNA 발현은 지방세포의 분화 시, platycodin D의 첨가에 의해 어떤 유의한 변화도 관찰되지 않았다(Fig. 5A). 그러나 CHOP의 mRNA 발현은 지방세포가 분화되면서 크게 감소되 었다가 분화 2일 째에 platycodin D의 첨가에 의해 유의하게 증가되 었다(Fig.
- C/EBP&의 상위에 위치한 KROX20은 과다 발현하였을 때 C/EB의 발현을 증가시키고 adipogenesis 를 유도하지만 또 한편으로는 C/EBI에 비의존적으로 adipogenesis을 조절한다고 보고하고 있다[이. 본 연구에서 KROX20의 mRNA 발현은 Fig. 4D에서 분화 초기(2일)에 크게 증가하지만 platycodin D의 첨가에 의해 유의하게 감소됨을 보였다. Fig.
- 그러나 분화 시 증가되는 KLF15의 mRNA 발현은 platycodin D의 처리에 의해 유의적으로 억제되었다. 이러한 결과는 platycodin D가 분화의 후기에서 KLF15의 mRNA 발현을 조절하여 adipogenesis의 핵심 인자인 PPARy의 억제함을 보여준다.
- PPARy의 상위 조절자인 KLF15는 후가 분화에서 PPARy의 promoter에 결합하여 전사를 조절하는 것으로 알려져 있는데 최근에는 terminal marker인 GLUT4의 발현을 직접조절한다고 보고되고 있다[7]. 이번 연구에서 KLF15의 mRNA 발현은 분화 전 세포에 비해 4일간 분화 된 세포에서 450배 이상 증가되었다(Fig. 4C). 그러나 분화 시 증가되는 KLF15의 mRNA 발현은 platycodin D의 처리에 의해 유의적으로 억제되었다.
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