방사선에 대한 방호와 면역기능 조절을 목적으로 새로운 생약복합조성물인 HemoHIM을 개발하였다. 식품 원료로 사용 가능한 생약재 3종 당귀, 천궁, 백작약의 에탄올 분획을 열수추출물에 첨가하여 HemoHIM을 제조하였다. HemoHIM의 항알레르기 효과를 검증하기 위하여 사람 비만세포주 HMC-1을 사용해 compound 48/80으로 유도되는 히스타민 분비량과 PMA/A23187로 유도되는 염증성 사이토카인의 분비량을 측정하였다. 히스타민의 양은 형광분석법으로, 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, TNF-$\alpha$, GM-CSF의 양은 효소결합 면역측정법으로 측정하였다. 저농도의 HemoHIM에 의해 히스타민 분비량이 억제되었고, 모든 농도에서 IL-6, TNF-$\alpha$, GM-CSF의 분비량은 억제되었지만 IL-8은 고농도에서만 억제되었다. 사이토카인의 mRNA 발현량은 HemoHIM의 농도 의존적으로 억제되었다. 그리고 c-kit와 Fc$\varepsilon$RI의 mRNA 발현량도 모든 농도에서 억제되었지만, tryptase의 mRNA 발현량은 저 농도에서만 억제되었다. 이상의 결과로 HemoHIM이 비만세포의 활성을 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었으며, 상대적으로 독성이 적은 항알레르기 제재로 개발할 가능성을 제시한 것으로 생각된다.
방사선에 대한 방호와 면역기능 조절을 목적으로 새로운 생약복합조성물인 HemoHIM을 개발하였다. 식품 원료로 사용 가능한 생약재 3종 당귀, 천궁, 백작약의 에탄올 분획을 열수추출물에 첨가하여 HemoHIM을 제조하였다. HemoHIM의 항알레르기 효과를 검증하기 위하여 사람 비만세포주 HMC-1을 사용해 compound 48/80으로 유도되는 히스타민 분비량과 PMA/A23187로 유도되는 염증성 사이토카인의 분비량을 측정하였다. 히스타민의 양은 형광분석법으로, 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, TNF-$\alpha$, GM-CSF의 양은 효소결합 면역측정법으로 측정하였다. 저농도의 HemoHIM에 의해 히스타민 분비량이 억제되었고, 모든 농도에서 IL-6, TNF-$\alpha$, GM-CSF의 분비량은 억제되었지만 IL-8은 고농도에서만 억제되었다. 사이토카인의 mRNA 발현량은 HemoHIM의 농도 의존적으로 억제되었다. 그리고 c-kit와 Fc$\varepsilon$RI의 mRNA 발현량도 모든 농도에서 억제되었지만, tryptase의 mRNA 발현량은 저 농도에서만 억제되었다. 이상의 결과로 HemoHIM이 비만세포의 활성을 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었으며, 상대적으로 독성이 적은 항알레르기 제재로 개발할 가능성을 제시한 것으로 생각된다.
In our previous study, a new herbal preparation (HemoHIM) was developed as a functional food for the radioprotection and immunomodulatory agents. In order elucidate the mechanism involved, we examined the effect of HemoHIM on the compound 48/80-induced histamine release, and on the phorbol 12-myrist...
In our previous study, a new herbal preparation (HemoHIM) was developed as a functional food for the radioprotection and immunomodulatory agents. In order elucidate the mechanism involved, we examined the effect of HemoHIM on the compound 48/80-induced histamine release, and on the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)/calcium ionophore (A23187)-induced inflammatory cytokine secretion in HMC-1. The cell culture supernatants were harvested, and the cytokines (IL-4, IL-6, IL-8, TNF-$\alpha$, GM-CSF) in the supernatants were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The total RNA of the cells was extracted, and the cytokines or c-kit/tryptase/Fc$\varepsilon$RI's messenger RNA expressions were examined using reverse transcriptase polymerase chain reaction. Under low concentrations, HemoHIM inhibited histamine release in HMC-1 stimulated compound 48/80. Furthermore HemoHIM inhibited PMA/A23187-induced inflammatory cytokines' secreation or mRNA expression in a dose-dependent manner. But IL-8 secretion was not inhibited by low concentrayion of HemoHIM, respectively. The mRNA expression of c-kit and Fc$\varepsilon$RI were also inhibited in a dose-dependent manner. Tryptase mRNA expression was only inhibited by low concentration of HemoHIM. These results indicated that HemoHIM might be an useful agent for protection against allergy as well as immune modulation, especially since it is a relatively nontoxic natural product.
In our previous study, a new herbal preparation (HemoHIM) was developed as a functional food for the radioprotection and immunomodulatory agents. In order elucidate the mechanism involved, we examined the effect of HemoHIM on the compound 48/80-induced histamine release, and on the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)/calcium ionophore (A23187)-induced inflammatory cytokine secretion in HMC-1. The cell culture supernatants were harvested, and the cytokines (IL-4, IL-6, IL-8, TNF-$\alpha$, GM-CSF) in the supernatants were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The total RNA of the cells was extracted, and the cytokines or c-kit/tryptase/Fc$\varepsilon$RI's messenger RNA expressions were examined using reverse transcriptase polymerase chain reaction. Under low concentrations, HemoHIM inhibited histamine release in HMC-1 stimulated compound 48/80. Furthermore HemoHIM inhibited PMA/A23187-induced inflammatory cytokines' secreation or mRNA expression in a dose-dependent manner. But IL-8 secretion was not inhibited by low concentrayion of HemoHIM, respectively. The mRNA expression of c-kit and Fc$\varepsilon$RI were also inhibited in a dose-dependent manner. Tryptase mRNA expression was only inhibited by low concentration of HemoHIM. These results indicated that HemoHIM might be an useful agent for protection against allergy as well as immune modulation, especially since it is a relatively nontoxic natural product.
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문제 정의
HemoHIM에 의한 염증성 사이토카인의 분비 억제 효과가각 사이토카인의 유전자 전사과정을 억제한 결과인지 알아보 기 위하여 사이토카인의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR법을 이 용하여 비교하였다. IL-6와 GM-CSF의 mRNA 발현량은 사이 토카인의 분비량과 같이 HemoHIM 처리에 의해 그 정도가 억제되는 것으로 나타났다(Fig.
비 만세포 막에 있는 Tyrosine kinase인 c-kit는 SCF (stem cell factor)와 결합하여 비만세포의 증식과 분화를 유도하는 수용 체이다[22]. 따라서 HemoHIM이 비만세포의 활성화시 분비 되는 단백분해효소, IgE에 대한 수용체인 FceRI, 그리고 분화 증식에 필요한 c-kit의 발현량을 억제하는 효과가 있는지 알아 보기 위하여, 각 유전자의 mRNA 발현량을 RT-PCR법으로 확인하였다. 그 결과 c-kit의 mRNA 발현량은 모든 농도에서 약 33-65% 억제되었고, FceRI의 mRNA 발현량은 HemoHIM 농도에 의존적으로 억제율이 증가하여 최대 약 82%까지 억제 되 었다(Fig.
그리고 IL-8 은 호중구, 림프구, 호산구의 동원을 촉진하는 화학주성 인자 로서, 호중구를 활성화시켜 리소좀 효소를 방출하고 활성산소 생산을 유발하며, 관절염 이나 패혈증 등과 같은 염증성질환에 관여한다 6 . 따라서 히스타민 분비를 억제하는 효과가 있는 HemoHIM이 염증성 사이토카인의 분비도 효과적으로 억제 하는지 확인하였다. HemoHIM을 농도별로 HMC-1에 처리한 후에 PMA와 A23187로 사이토카인의 분비를 유도하였다.
방사선에 대한 방호와 면역기능 조절을 목적으로 새로운 생약복합조성물인 HemoHIM을 개발하였다. 식품 원료로 사 용 가능한 생약재 3종 당귀, 천궁, 백작약의 에탄올 분획을 열수추출물에 첨가하여 HemoHIM을 제조하였다.
본 실험은 생약복합조성물인 HemoHIM의 알레르기 억제효과를 체계적으로 평가하기 위한 목적으로, 사람 비만세포주 HMC-1의 histamine 및 염증성 cytokine인 IL-6, IL-8, TNF-a, GM-CSF의 분비 억제에 미치는 효과와, 비만세포 분화 증식 유전자인 c-Kit와 단백분해효소 tryptase의 발현 억제 정도를 측정하여 HemoHIM의 항알레르기 효과를 검증하는 것을 목 적으로 하였다.
본 연구팀에서는 동양의학에서 사용되고 있는 다양한 생약 재 및 한약처방제의 방사선에 대한 보호 효과를 보고한 바 있으며[7,12-16,19,24], 최근에 식품 원료로 사용 가능한 생약재 3종 당귀, 천궁, 백작약을 이용하여 새로운 생약복합물(HIM-I) 을 개발하여 면역세포 활성화 효과, 면역 · 조혈계 회복촉진 효과, 재생조직 및 면역조혈계의 방어 효과, 항산화 효과에 대해 보고하였다[27]. 그리고 HIM-I에서 면역 및 조혈기능 활 성화 효과가 강화된 새로운 생약복합조성물을 개발하고자 HIM-I에 그 조다당 분획이 첨가된 HemoHIM을 제조하였다.
제안 방법
사람 비만세포주 HMC-1 (3×106개)에 시료를 농도별로 처 리하여 37℃에서 30분 동안 배 양한 다음, compound 48/80 (300 μg/ml)을 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. Compound 48/80을 처리한 세포는 가볍게 원심 분리하여 상층액을 수거 하였고, 상층액에 포함된 히스타민은 OPT와 반응시 킨 후 측 정하였다. 즉 상층액 속에 포함된 histamine의 양을 측정하기 위해 상층액 500 μl에 0.
추 출물의 고형분을 제거하고 감압농축하여 생약복합물 HIM-I을 얻었다. HIM-I의 일부를 취하여 4배 부피의 100% 에탄올 주정 을 첨가하고(최종 에탄올 농도 약 80%), 25℃ 이하에서 16시간 정치한 후, 원심분리하여 침전된 조다당 분획(HIM-I-P)과 상층 의 에탄올 분획(MM-LE)을 수거하였다. 수거한 조다당 분획의 일부를 이에 해당하는 HIM-I에 첨가하여 생약복합조성물 HemoHIM을 제조하였다.
식품 원료로 사 용 가능한 생약재 3종 당귀, 천궁, 백작약의 에탄올 분획을 열수추출물에 첨가하여 HemoHIM을 제조하였다. HemoHIM 의 항알레르기 효과를 검증하기 위하여 사람 비만세포주 HMC-1을 사용해 compound 48/80으로 유도되는 히스타민 분비량과 PMA/A23187로 유도되는 염증성 사이토카인의 분 비량을 측정하였다. 히스타민의 양은 형광분석법으로, 염증성 사이토카인 IL6, IL-8, TNF-a, GM-CSF의 양은 효소결합 면역 측정법으로 측정하였다.
따라서 히스타민 분비를 억제하는 효과가 있는 HemoHIM이 염증성 사이토카인의 분비도 효과적으로 억제 하는지 확인하였다. HemoHIM을 농도별로 HMC-1에 처리한 후에 PMA와 A23187로 사이토카인의 분비를 유도하였다. 그 결과 GM-CSF의 분비 량은 HemoHIM을 처 리하였을 때, 대조 군 2.
자극한 세포를 모아 원심분리하여 상층액을 제거하고, RNAzol을 이용하여 RNA를 추출하였다. Total RNA 1 μg을 75℃ 에서 5분간 변성시 킨 후, dNTP (1 mM), oligo (dT)15 (0.5 U AMV reverse transcriptase (20 U), RNase inhibitor (0.5 U), RT buffer, MgCl2 (5 mM)와 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 20 μl가 되도록 하여, 42℃에서 30분간 반응시 켜 cDNA 를 합성하여 효소중합연쇄반응에 사용하였다. 효소중합연쇄 반응은 합성 된 cDNA 2 μ1을 주형으로 FceRIa, tryptase, c-kit 와 GAPDH의 sense primer와 antisense primer (15 pmol), Taq polymerase (0.
본 연구팀에서는 동양의학에서 사용되고 있는 다양한 생약 재 및 한약처방제의 방사선에 대한 보호 효과를 보고한 바 있으며[7,12-16,19,24], 최근에 식품 원료로 사용 가능한 생약재 3종 당귀, 천궁, 백작약을 이용하여 새로운 생약복합물(HIM-I) 을 개발하여 면역세포 활성화 효과, 면역 · 조혈계 회복촉진 효과, 재생조직 및 면역조혈계의 방어 효과, 항산화 효과에 대해 보고하였다[27]. 그리고 HIM-I에서 면역 및 조혈기능 활 성화 효과가 강화된 새로운 생약복합조성물을 개발하고자 HIM-I에 그 조다당 분획이 첨가된 HemoHIM을 제조하였다.
05% Tween 20/PBS)로 세척한 다음, 10% FCS를 첨가한 PBS로 2시간 동안 blacking하였다. 다시 세척 후 배양 상층액 을 적 절하게 희 석하여 넣어 반응시 키 고, 4시간 후에 washing 용액으로 세척하고 이차 항체 biotin-conjugated anti-TNF-a, GM-CSF, IL-6, IL-8 mAb를 첨가하였다. 다시 1시간 후에 washing용액으로 세척한 다음, avidin-peroxidase를 첨가하 고, 기질(2, 2z-azino-bis, 0.
비만세포를 활성화시 키는 compound 48/80은 phenethylamine의 혼합 다 당체로서 세포 외 칼슘이 세포 내로 유입되는 것을 유발한다 34,35 , 세포 내 칼슘이온의 농도가 증가하면 다양한 2차 신호 전달물질에 세포 내부로 신호가 전달되어 비만세포의 탈과립이 일어나 히스타민이 분비된다 2이. 따라서 사람 비만세포주 HMC-1에 HemoHIM을 농도별로 처리한 후에 compound 48/80으로 히스타민 분비를 유도하여 HemoHIM의 히스타민 분비 억제 효과를 관찰하였다. 그 결과, 대조군 7.
사람 비만세포주 HMC-1 (3×106개)에 시료를 농도별로 처 리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배 양한 후, PMA (25 ng/ml)와 A23187 (1 μM)로 2시간 동안 자극하였다.
사람 비만세포주 HMC-1 (5×105개)에 시료를 농도별로 처 리한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배 양하였 다. 시료를 처리한 세포는 다시 PMA (25 ng/ml)와 A23187 (1 μM)을 첨가하여 24시간 동안 반응시킨 후 배양 상층액을 수거하였다.
HIM-I의 일부를 취하여 4배 부피의 100% 에탄올 주정 을 첨가하고(최종 에탄올 농도 약 80%), 25℃ 이하에서 16시간 정치한 후, 원심분리하여 침전된 조다당 분획(HIM-I-P)과 상층 의 에탄올 분획(MM-LE)을 수거하였다. 수거한 조다당 분획의 일부를 이에 해당하는 HIM-I에 첨가하여 생약복합조성물 HemoHIM을 제조하였다. 제조한 HemoHIM은 동결건조하여 냉동 저장하였으며, 실험 직전에 증류수에 녹여 사용하였다.
방사선에 대한 방호와 면역기능 조절을 목적으로 새로운 생약복합조성물인 HemoHIM을 개발하였다. 식품 원료로 사 용 가능한 생약재 3종 당귀, 천궁, 백작약의 에탄올 분획을 열수추출물에 첨가하여 HemoHIM을 제조하였다. HemoHIM 의 항알레르기 효과를 검증하기 위하여 사람 비만세포주 HMC-1을 사용해 compound 48/80으로 유도되는 히스타민 분비량과 PMA/A23187로 유도되는 염증성 사이토카인의 분 비량을 측정하였다.
자극한 세포를 모아 원심분리하여 상층액을 제거하고, RNAzol을 이용하여 RNA를 추출하였다. Total RNA 1 μg을 75℃ 에서 5분간 변성시 킨 후, dNTP (1 mM), oligo (dT)15 (0.
효소중합연쇄반응의 products 20 μ1 씩 2% agarose gel에 loading하여 100 V에서 40분 간 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV 하에서 관찰하였다. 전기영동 밴드의 밀도는 Densitometer (Bio-Rad Laboratories, Inc. Gel Doc™ XR)를 이용하여 측정하고 대조 군에 대한 상대적 밀도를 측정하였다.
서울 경 동 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종, 즉 당귀(Danggui, Angelica gigas Nakai)의 뿌리, 천궁(Chuanxiong, Cnidium officinale Makino)의 근경, 백작약(Baishaoyao, Paeonia japonica Miyabe)의 뿌리를 동일한 무게비율로 혼합한 후, 혼합 생약재 100 g당 증류수 1,000 ml을 가하고 4시간 열탕 추출하였다. 추 출물의 고형분을 제거하고 감압농축하여 생약복합물 HIM-I을 얻었다. HIM-I의 일부를 취하여 4배 부피의 100% 에탄올 주정 을 첨가하고(최종 에탄올 농도 약 80%), 25℃ 이하에서 16시간 정치한 후, 원심분리하여 침전된 조다당 분획(HIM-I-P)과 상층 의 에탄올 분획(MM-LE)을 수거하였다.
5 U), RT buffer, MgCl2 (5 mM)와 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 20 μl가 되도록 하여, 42℃에서 30분간 반응시 켜 cDNA 를 합성하여 효소중합연쇄반응에 사용하였다. 효소중합연쇄 반응은 합성 된 cDNA 2 μ1을 주형으로 FceRIa, tryptase, c-kit 와 GAPDH의 sense primer와 antisense primer (15 pmol), Taq polymerase (0.5 U), polymerase buffer를 DEPC로 처 리 된 증류수로 최종 부피가 20 μ1되도록 하여 predenaturation; 95℃ 5분, denaturation; 94℃ 1분 annealing; 55℃ 30초, elongation; 72℃ 1분을 40 cycle한 다음, postelongation을 72℃에 서 5분하는 조건으로 수행하였다. 효소중합연쇄반응의 products 20 μ1 씩 2% agarose gel에 loading하여 100 V에서 40분 간 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV 하에서 관찰하였다.
5 U), polymerase buffer를 DEPC로 처 리 된 증류수로 최종 부피가 20 μ1되도록 하여 predenaturation; 95℃ 5분, denaturation; 94℃ 1분 annealing; 55℃ 30초, elongation; 72℃ 1분을 40 cycle한 다음, postelongation을 72℃에 서 5분하는 조건으로 수행하였다. 효소중합연쇄반응의 products 20 μ1 씩 2% agarose gel에 loading하여 100 V에서 40분 간 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV 하에서 관찰하였다. 전기영동 밴드의 밀도는 Densitometer (Bio-Rad Laboratories, Inc.
대상 데이터
또한 cytokine 측정에 필요한 항체는 PharMingen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였으 며, RT-PCR에 필요한 시약 reverse transcriptase, dNTP Mixure, oligo (dT) 15 primer, Taq. DNA polymerase 등은 Promega (Madison, WI, USA) 제품을 사용하였다.
사람 비만세포주 HMC-1은 IMDM 배지에 NaHCO3 (3.024 g/1, 항생제(100 units/ml penicillin G sodium, 100 |ig/ml streptomycin sulfate, 0.25 |ig/ml amphotericin B), 2-ME (50 μM 첨가된 10% FBS 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
생약복합조성물(HemoHIM)은 아래와 같은 방법으로 제조 한 시료를 (주)선바이오텍에서 제공받아 사용하였다. 서울 경 동 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종, 즉 당귀(Danggui, Angelica gigas Nakai)의 뿌리, 천궁(Chuanxiong, Cnidium officinale Makino)의 근경, 백작약(Baishaoyao, Paeonia japonica Miyabe)의 뿌리를 동일한 무게비율로 혼합한 후, 혼합 생약재 100 g당 증류수 1,000 ml을 가하고 4시간 열탕 추출하였다.
생약복합조성물(HemoHIM)은 아래와 같은 방법으로 제조 한 시료를 (주)선바이오텍에서 제공받아 사용하였다. 서울 경 동 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종, 즉 당귀(Danggui, Angelica gigas Nakai)의 뿌리, 천궁(Chuanxiong, Cnidium officinale Makino)의 근경, 백작약(Baishaoyao, Paeonia japonica Miyabe)의 뿌리를 동일한 무게비율로 혼합한 후, 혼합 생약재 100 g당 증류수 1,000 ml을 가하고 4시간 열탕 추출하였다. 추 출물의 고형분을 제거하고 감압농축하여 생약복합물 HIM-I을 얻었다.
세포배 양에 필요한 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)과 항생 제는 Gibco (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였으며, fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone (Logan, UT, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 2-mercaptoethanol(2ME)과 sodium bicarbonate (NaHCOs), compound 48/80, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), A23187 (calcium ionophore)는 Sigma (St.
세포배 양에 필요한 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)과 항생 제는 Gibco (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였으며, fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone (Logan, UT, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 2-mercaptoethanol(2ME)과 sodium bicarbonate (NaHCOs), compound 48/80, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), A23187 (calcium ionophore)는 Sigma (St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 또한 cytokine 측정에 필요한 항체는 PharMingen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였으 며, RT-PCR에 필요한 시약 reverse transcriptase, dNTP Mixure, oligo (dT) 15 primer, Taq.
이론/모형
시료를 처리한 세포는 다시 PMA (25 ng/ml)와 A23187 (1 μM)을 첨가하여 24시간 동안 반응시킨 후 배양 상층액을 수거하였다. 상층액에 포함된 TNF-a, GM-CSF, IL-6, IL-8의 양은 효소항체 법 (enzyme-linked immunosorbent assay)을 이 용하여 측정하였다. 즉, 일차항체 anti-TNF-a, GM-CSF, IL-6, IL-8 mAb를 coating buffer (0.
HemoHIM 의 항알레르기 효과를 검증하기 위하여 사람 비만세포주 HMC-1을 사용해 compound 48/80으로 유도되는 히스타민 분비량과 PMA/A23187로 유도되는 염증성 사이토카인의 분 비량을 측정하였다. 히스타민의 양은 형광분석법으로, 염증성 사이토카인 IL6, IL-8, TNF-a, GM-CSF의 양은 효소결합 면역 측정법으로 측정하였다. 저농도의 HemoHIM에 의해 히스타 민 분비 량이 억제되었고, 모든 농도에서 IL-6, TNF-a, GM-CSF 의 분비량은 억제되었지만 IL-8은 고농도에서만 억제되었다.
성능/효과
HemoHIM에 의한 염증성 사이토카인의 분비 억제 효과가각 사이토카인의 유전자 전사과정을 억제한 결과인지 알아보 기 위하여 사이토카인의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR법을 이 용하여 비교하였다. IL-6와 GM-CSF의 mRNA 발현량은 사이 토카인의 분비량과 같이 HemoHIM 처리에 의해 그 정도가 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 1). 그러나 저농도의 HemoHIM 처리로 분비량이 억제되었던 TNF-a의 경우에는 저농도에서 mRNA 발현량이 거의 억제되지 않았다.
하지만 염증성 케모카인 IL-8의 분비량은 저농도에서는 억제효과가 나타나지 않았지 만, HemoHIM 100 μg/ml에서만 약 18% 정도 억제되었다. TNF-a의 경우에 대조군 789.4±31.4 pg/ml에 비해 HemoHIM 을 농도별로 처리하였을 때, 약 43-55% 정도 분비량이 억제되 었고, IL-6의 경우에도 대조군 1,830.0±106.1 pg/ml과 비교하 였을 때, HemoHIM의 각 농도에서 약 32-42% 정도 분비 량이 억제되는 것을 확인하였다. IL-6와 TNF-a의 분비량은 실험한 모든 농도에서 비슷한 억제효과를 나타내었는데, 이는 HemoHIM이 두 종류의 사이토카인 생산에 더 민감한 작용을 나타내는 것으로 GM-CSF 분비 량과는 다른 신호전달 과정에 관여할 가능성이 있는 것으로 생각된다.
HemoHIM을 농도별로 HMC-1에 처리한 후에 PMA와 A23187로 사이토카인의 분비를 유도하였다. 그 결과 GM-CSF의 분비 량은 HemoHIM을 처 리하였을 때, 대조 군 2.95±0.41 ng/ml에 비하여 약 27-45% 정도 분비 량이 농도 의존적으로 억제되었다(Table 2). 하지만 염증성 케모카인 IL-8의 분비량은 저농도에서는 억제효과가 나타나지 않았지 만, HemoHIM 100 μg/ml에서만 약 18% 정도 억제되었다.
따라서 HemoHIM이 비만세포의 활성화시 분비 되는 단백분해효소, IgE에 대한 수용체인 FceRI, 그리고 분화 증식에 필요한 c-kit의 발현량을 억제하는 효과가 있는지 알아 보기 위하여, 각 유전자의 mRNA 발현량을 RT-PCR법으로 확인하였다. 그 결과 c-kit의 mRNA 발현량은 모든 농도에서 약 33-65% 억제되었고, FceRI의 mRNA 발현량은 HemoHIM 농도에 의존적으로 억제율이 증가하여 최대 약 82%까지 억제 되 었다(Fig. 2). 그러나 Tryptase mRNA 발현량은 HemoHIM 1 ,ml에서 최대 약 64%까지 억제되었으나, 10, 100 μg/ml 에서는 억제효과가 나타나지 않았다.
따라서 사람 비만세포주 HMC-1에 HemoHIM을 농도별로 처리한 후에 compound 48/80으로 히스타민 분비를 유도하여 HemoHIM의 히스타민 분비 억제 효과를 관찰하였다. 그 결과, 대조군 7.42± 0.91 ng/ ml에 비해 compound 48/80을 처리한 실험군은 26.49±0.55 ng/ml로 히스타민 분비량이 증가하였다(Table 1). 여기에 HemoHIM 0.
사이토카인의 mRNA 발현량은 HemoHIM의 농도 의존적으 로 억제되었다. 그리고 c-kit와 FceRI의 mRNA 발현량도 모든 농도에서 억제되었지만, tryptase의 mRNA 발현량은 저 농도 에서만 억제되었다. 이상의 결과로 HemoHIM이 비만세포의 활성을 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었으며, 상대적 으로 독성이 적은 항알레르기 제재로 개발할 가능성을 제시한 것으로 생각된다.
55 ng/ml로 히스타민 분비량이 증가하였다(Table 1). 여기에 HemoHIM 0.1, 1, 10 μg/ml을 처리한 실험군에서는 약 25%, 38%, 12% 정도 히스타민 분비가 억제되는 것을 관찰하였으며, 특히 HemoHIM 1 μg/ml에서 가장 억제 효과가 큰 것으로 나 타났다. 그러나 고농도인 100 μg/ml을 처리하였을 때는 히스 타민 분비량이 약간 증가하는 것으로 나타났다.
히스타민의 양은 형광분석법으로, 염증성 사이토카인 IL6, IL-8, TNF-a, GM-CSF의 양은 효소결합 면역 측정법으로 측정하였다. 저농도의 HemoHIM에 의해 히스타 민 분비 량이 억제되었고, 모든 농도에서 IL-6, TNF-a, GM-CSF 의 분비량은 억제되었지만 IL-8은 고농도에서만 억제되었다. 사이토카인의 mRNA 발현량은 HemoHIM의 농도 의존적으 로 억제되었다.
그러나 Tryptase mRNA 발현량은 HemoHIM 1 ,ml에서 최대 약 64%까지 억제되었으나, 10, 100 μg/ml 에서는 억제효과가 나타나지 않았다. 히스타민 분비 억제 실 험에서도 HemoHIM 1 μg/ml에서 최대 억제 효과가 나타나 고 고농도에서는 억제 효과가 감소하는 현상이 나타났다. 이 것은 다당체가 주성분인 HemoHIM이 고농도에서 서로 결합 하여 오히려 억제 효과가 감소하여 나타나는 결과일 가능성이 있다고 생각된다.
후속연구
그리고 c-kit와 FceRI의 mRNA 발현량도 모든 농도에서 억제되었지만, tryptase의 mRNA 발현량은 저 농도 에서만 억제되었다. 이상의 결과로 HemoHIM이 비만세포의 활성을 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었으며, 상대적 으로 독성이 적은 항알레르기 제재로 개발할 가능성을 제시한 것으로 생각된다.
참고문헌 (35)
Arend, W. P. and J. M. Dayer. 1995. Inhibition of the production and effects of interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 38, 151-160
Butler, D. M., R. N. Maini, M. Feldmann, and F. M. Brennan. 1995. Modulation of proinflammatory cytokine release in rheumatoid synovial membrane cell cultures. Comparison of monoclonal anti TNF-alpha antibody with the interleukin-1 receptor antagonist. Eur. Cytokine Netw. 6, 225-230
Caufield, J. P., R. A. Lois, A. Hein, and K. F. Austen. 1980. Secretion in dissociated human plumanary mast cells. Evidence for solubilization of granule contents before discharge. J. Cell BioI. 85, 29-37
Erchler, W. B. and E. T. Keller. 2000. Age-associated increased interleukin-6 gene expression, late-life diseases, and frailty. Annu. Rev. Med. 51, 245-270
Harada, A., N. Mukaida, and K. Matsushima. 1996. Interleukin 8 as a novel target for intervention theraphy in acute inflammatory disease. Mol. Med. Today 2, 482-489
Jo, S. K., Y. B. Yu, H. Oh, S. R. Kim, and S. H. Kim. 2000. The effects of Shi-Quan-Dai-Bu-Tang and its ingredients on the survival of jejunal crypt cells and hematopoietic cells in irradiated mice. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 29, 93-98
Jo, S. K., H. R. Park, U. H. Jung, H. Oh, S. H. Kim, and S. E. Lee. 2005. Protective effect of a herbal preparation (HemoHIM) on the self-renewal tissues and immune system against $\gamma$ -Irradiation. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 34, 805-813
Kang, K. J., B. D. Jun, O. H. Chai, and M. S. Lee. 1993. Inhibitory effects of Mori cortex on compound 48/80-induced histamine release and calcium uptake of rat peritoneal mast cells. Korean J. Immunol. 15, 91-99
Kang, O. K., H. S. Chae, J. H. Choi, H. J. Choi, P. S. Park, S. H. Cho, G. H. Lee, H. Y. So, Y. K. Choo, O. H. Kweon, and D. Y. Kwon. 2006. Effect of the Schisandra fructus water extract on cytokine release from human mast cell line. J. Med. Food 9, 480-486
Kay, A. B. 2006. The role of T lymphocyte in asthma. Chem. Immunol. Allergy 91, 59-75
Kim, S. H., S. E. Lee, H. Oh, S. R. Kim, S. T. Yee, Y. B. Yu, M. W. Byun, and S. K. Jo. 2002. The radioprotective effects of Bu- Zhong-Yi-Qi-Tang: A prescription of traditional Chinese medicine. Am. J. Chin. Med. 30, 127-137
Kim, S. H., S. E. Lee, H. Oh, J. A. Yang, C. Y. Chung, J. S. Jang, Y. B. Yu, and S. K. Jo. 1999. The radioprotective effect of Kuei-Pi- Tang as a prescription of traditional Chinese medicine in mice. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 28, 698-704
Kim, S. H., M. R. An, S. Y. Nah, J. H. Lee, J. H. Kim, S. K. Jo, S. J. Jang, and D. H. Shin. 2001. The effects of herbs on the radiation-induced apoptosis in intestinal crypt cells. J. Korean Assoc. Radiat. Prot. 26, 27-33
Kim, S. H., H. Oh, S. R. Kim, S. K. Jo, M. W. Byun, K. S. Kim, J. H. Lee, and D. H. Shin. 2001. The radioprotective effects of radices herbs. Korea J. Vet. Res. 41, 105-111
Kim, S. H., H. Oh, E. S. Lee, S. K Jo, and M. W. Byun. 1998. Effect of Si-Wu-Tang and Si-Jun-Zi-Tang on the survival of jejunal crypt cells and hematopoietic cells in irradiated mice. Korean J. Food Sci. Technol. 30, 888-894
Kim, S. H., D. K. Kim, B. S. Chae, and T. Y. Shin. 2003. Inhibitory effect of Isodon japonicus Hara on mast cell-mediated immediate-type allergic reaction. Kor. J. Pharmacogn. 34, 132-137
Lee, S. W., Y. M. Ye, J. H. Choi, S. H. Kim, C. H. Suh, and D. H. Nahm. et al. 2004. Measurement of serum tryptase in the diagnosis of systemetic allergic reaction. Korean J. Med. 67, 185-189
Lee, S. E., H. Oh, J. A. Yang, S. K. Jo, M. W. Byun, S. T. Yee, and S. H. Kim. 1999. Radioprotective effects of two traditional Chinese medicine prescriptions: Si-Wu-Tang and Si-Jun-Zi-Tang. Am. J. Chin. Med. 27, 387-396
Lee, M. S., Y. G. Ryu, O. K. Chai, K. J. Kang and J. Y. Lee. 1999. Inhibitory effect of polysaccharide fraction from Cortex mori on compound 48/80-induced mast cell activation. Korean J. Immunol. 21, 35-45
Li, G. Z., O. H. Chai, and C. H. Song. 2004. Inhibitory effect of Rubus coreanus on compound 48/80- or anti-DNP IgE-induced mast cell activation. Immune. Network 4, 100-107
Makowska, J. S., M. Cieslak, and M. L. Kowalski. 2009. Stem cell factor andits soluble receptor (c-kit) in serum of asthmatic patients-correlation with disease severity. BMC. Pulm. Med. 9, 27-33
Manning, A. M., F. P. Bell, C. L. Rosenbloom, J. G. Chosay, C. A Simmons, J. L. Northrup, R. J. Shebuski, C. J. Dunn, and D. C. Anderson. 1995. NF-kappa B is activated during acute inflammation in vivo in association with elevated endothelial cell adhesion molecule gene expression and leukocyte recruitment. J. Inflamm. 45, 283-296
Oh, H., H. R. Park, I. Y. Jeong, S. H. Kim, and S. K. Jo. 2002. Protective effects of Paeonia japonica against radiation-induced damage. J. Korean Assoc. Radiat. Prot. 27, 181-188
Papageorgiou, P. S. 2002. Clincal aspects of food allergy. Biochem. Soc. Trans. 30, 901-906
Park, H. R., E. J. Ju, S. K. Jo, U. Jung, S. H. Kim, and S. T. Yee. 2009. Enhanced antitumor efficacy of cisplatin in combination with HemoHIM in tumor-bearing mice. BMC Cancer 9, 1-10
Park, H. R., S. H. Kim, S. T. Yee, M. W. Byun, and S. K. Jo. 2005. Effects of a herb mixture (HIM-I) on the protection of the hematopoietic-immune system and self-renewal tissues against radiation damage. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 34, 605-612
Pastore, S., E. Fanales-Belasio, C. Albanesi, LM. Chinni, A Giannetti, and G. Girolomoni. 1997. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor is overproduced by keratinocytes in atopic dermatitis. Implications for sustained dendritic cell activation in the skin. J. Clin. Invest 99, 3009-3017
Platts-Mills, T. 2001. Hypersensitivity-Type I, pp. 323-343, In Roitt, I., J. Brostoff, and D. Male (6th eds.), Immunology, Gower medical publishing
Scheller, S., S. Dworniczak, T. Pogorzelska, M. Rajca, and J. Shani. 2000. Effect of quercetin, caffeic acid and caffeic acid phenylethyl ester, solubilized in non-ionic surfactants, on histamine release in vivo and in vitro. Arzneimittelforschung. 50, 72-76
Seo, U. K., J. I. Lee, J. H. Park, and Y. K. Park. 2008. The ethylacetate extract of north kangwhal (Ostericum koreanum) attenuates the inflammatory responses in PM A/ A23187-stimulated mast cells. Kor. J. Herbology 23, 81-89
Shin, T. Y. and D. K. Kim. 2000. Inhibitory effect of mast cell-dependent anaphylaxis by Gleditsia sinesis. Arch. Pharm. Res. 23, 401-406
Tasaka, K., M. Mio, K. Izushi, and I. Aoki. 1991. Role of the cytoskeletons on $Ca^{2+}$ release from the intracellular $Ca^{2+}$ store of rat peritoneal mast cell Skin. Pharmacol. 4, 43-52
Yoshii, N., M. Mio, M. Akagi, and K Tassaka. 1991. Role of endoplasmic reticulum, an intracellular $Ca^{2+}$ store in histamine release from rat peritoneal mast cell. Immunapharmacol. 21, 13-24
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