[논문]염기서열을 이용한 한약재 형개의 기원 및 유연관계 분석

배갈마; 김명겸; 노종훈; 손화; 양덕춘

염기서열을 이용한 한약재 형개의 기원 및 유연관계 분석
Phylogenetic Analysis of Schizonepeta Spike on the Basis of DNA Sequences 원문보기

韓國藥用作物學會誌 = Korean journal of medicinal crop science, v.17 no.1, 2009년, pp.46 - 53

배갈마 (경희대학교 고려인삼명품화사업단 및 인삼유전자원소재은행) , 김명겸 (경희대학교 고려인삼명품화사업단 및 인삼유전자원소재은행) , 노종훈 (경희대학교 고려인삼명품화사업단 및 인삼유전자원소재은행) , 손화 (경희대학교 고려인삼명품화사업단 및 인삼유전자원소재은행) , 양덕춘 (경희대학교 고려인삼명품화사업단 및 인삼유전자원소재은행)

Abstract ▼ AI-Helper

Schizonepeta spike (Korean name "Hyung-Gae") has been used for oriental medicinal purposes in Korea, China and Japan. In this study, twenty six "Hyung-Gae" samples were collected including nine certified Schizonepeta tenuifolia plants, and seventeen commercially marketed "Hyung-Gae" products. Chloroplast trnL-F and rDNA ITS regions of the "Hyung-Gae" samples were sequenced and used to identify whether the samples were genuine S. tenuifolia or not. As the result, the trnL-F and ITS sequences of all the "Hyung-Gae" samples were shown to be identical and it was proven that commercially available medicinal products "Hyung-Gae" are genuine S. tenuifolia. Phylogenetic tree of S. tenuifolia using the trnL-F sequences was constructed and compared with phylogenetic tree using ITS of rDNA region sequences. In these tree, S. tenuifolia was affiliated in the family Lamiaceae. It is proven that trnL-F and ITS phylogenetic trees are useful to study taxonomic position of S. tenuifolia.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구를 통해 명확한 형개의 기원식물을 정립하여 엄격한 품질 기준을 마련하여 저가의 위품유입을 막고, 한약재의 오용 및 남용을 방지하여 궁극적으로 한약재의 품질관리 및 국민건강의 안정성 확보를 하고자 형개의 기원에 관한 연구를 수행하였다.
2). 따라서 본 연구에서 얻어진 형개 trnL-F 염기서열을 분석한 염기서열을 이용하여 NCBI에 보고 된 식물들과의 상동성을 조사하였다. 형개의 trnL-F 염기서열은 Agastache rugosa trnL-F (EU244612, Identities = 818/849 (96%)), Agastache urticifolia trnL-F (AY570452, Identities = 819/851 (96%)), Lepechinia chamaedryoides trnL-F (AY570459, Identities =816/851 (95%)), Lepechinia lancifolia trnL-F (DQ667492, Identities = 812/853 (95%))와 유사한 것으로 나타났다.

제안 방법

ITS 계통수의 유용성을 확인하기 위하여 ITS 유전자 염기서열을 이용하여 계통수를 그리고, trnL-F 계통수와 비교해 보 았다. ITS유전자 염기서열의 정렬 결과, 형개와 가장 가까운 종은 같은 Schizonepeta 속 (genus) S.
ITS 염기서열을 결정하기 위해서는, ITS 영역의 universal primer인 P1와 4R 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 프라이머의 염기서열은 P1 (5'-TAC CGA TTG AAT GRT CCG -3')와 4R (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3')이었으며, PCR condition은 pre-denaturation 94℃, 5 min; denaturation 94℃, 30 sec; annealing 50℃, 30 sec; extension 72℃, 90 sec; 36 cycles 이었다.
확인은 agarose gel 과 UV spectrophotometer를 사용하여 분리된 DNA를 정량하였다. TrnL-F 염기서열을 결정하기 위해는 trnL-F 영역의 universal primer인 c와 f 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 프라이머의 염기서열은 c (5'-CGA AAT CGG TAG ACG CTA-3')와 f (5'-ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG-3')이었으며, PCR condition은 pre-denaturation 96℃, 2 min; denaturation 96℃, 30 sec; annealing 50℃, 30 sec; extension 72℃, 90 sec; 36 cycles 이었고 증폭된 PCR 산물을 정제하여 사용하였다.
NCBI에서 꿀풀과 (Lamiaceae)로 분류된 19개 종 (species)의 trnL-F 염기서열을 다운받았다. 다운받은 염기서열들을 ClustalX 프로그램을 이용하여 정렬하였고, 정렬된 염기서열의 개수는 outgroup으로 넣은 인삼 (Panax ginseng)의 염기서열 까지 21개였다. 정렬된 전체 염기서열의 크기는 813 bp이었고, 형개의 경우 정렬에 포함된 염기서열은 685 bp이었다 (Fig.
증폭된 PCR 산물을 정제하여 염기서열을 결정하였다. 얻어진 형개의 염기서열들을 NCBI에서 Blast하였으며, 계통수 (Phylogenetic Tree)를 그리기 위하여 Bioedit 프로그램으로 식물체와 한약재의 염기서열들을 편집한 다음, ClustalX 프로그램으로 염기서열을 정렬하였다. 계통수는 MEGA4 프로그램을 사용하여 구축하였다.
프라이머의 염기서열은 P1 (5'-TAC CGA TTG AAT GRT CCG -3')와 4R (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3')이었으며, PCR condition은 pre-denaturation 94℃, 5 min; denaturation 94℃, 30 sec; annealing 50℃, 30 sec; extension 72℃, 90 sec; 36 cycles 이었다. 증폭된 PCR 산물을 정제하여 염기서열을 결정하였다. 얻어진 형개의 염기서열들을 NCBI에서 Blast하였으며, 계통수 (Phylogenetic Tree)를 그리기 위하여 Bioedit 프로그램으로 식물체와 한약재의 염기서열들을 편집한 다음, ClustalX 프로그램으로 염기서열을 정렬하였다.
프라이머의 염기서열은 c (5'-CGA AAT CGG TAG ACG CTA-3')와 f (5'-ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG-3')이었으며, PCR condition은 pre-denaturation 96℃, 2 min; denaturation 96℃, 30 sec; annealing 50℃, 30 sec; extension 72℃, 90 sec; 36 cycles 이었고 증폭된 PCR 산물을 정제하여 사용하였다.
형개 샘플에서 DNA를 분리하기 위해서는 액체질소로 얼린후 유발에서 마쇄하고 plant DNA isolation kit(Invitek. Spin Plant Kit)를 이용하여 총 DNA를 추출하였다. 확인은 agarose gel 과 UV spectrophotometer를 사용하여 분리된 DNA를 정량하였다.
형태적으로 종이 확인된 S. tenuifolia 형개 샘플에서 DNA 를 분리하고 trnL-F 영역과 ITS 영역을 PCR 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. 형개의 trnL-F 영역은 trnL 유전자의 intron 크기가 484 bp, trnL 유전자의 3'exon의 크기가 50 bp, trnL 유전자와 trnF exon 사이의 intergenic non-coding 영역이 297 bp 이어서 모두 831 bp 크기를 가지고 있었다(Fig.
Spin Plant Kit)를 이용하여 총 DNA를 추출하였다. 확인은 agarose gel 과 UV spectrophotometer를 사용하여 분리된 DNA를 정량하였다. TrnL-F 염기서열을 결정하기 위해는 trnL-F 영역의 universal primer인 c와 f 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다.

대상 데이터

NCBI에서 꿀풀과 (Lamiaceae)로 분류된 19개 종 (species)의 trnL-F 염기서열을 다운받았다. 다운받은 염기서열들을 ClustalX 프로그램을 이용하여 정렬하였고, 정렬된 염기서열의 개수는 outgroup으로 넣은 인삼 (Panax ginseng)의 염기서열 까지 21개였다.
tenuifolia을 수집하였다. 기존에 형태학적으로 분류가 이루어져서 기원이 확인된 S. tenuifolia 형개식물체 2개는 농촌진흥청 작물과학원과, 경희대 국제캠퍼스 약초농장에서 수집하였으며, 24종은 대학에서 분류학을 하고 있는 실험실에서 한약재를 수집하였고, 또한 시중 한약재시장에서는 형개로 판매되고 있는 한약재를 무작위로 구입하여 총 26개의 형개 샘플을 가지고 본 실험에 사용하였다 (Table 1).
본 연구에 사용된 형개 샘플은 주로 한국과 중국의 시장에서 한약재로 유통되고 있는 것을 사용하였으며, 명확한 기원을 확인하기 위해서는 기존에 재배되고 있는 S. tenuifolia을 수집하였다. 기존에 형태학적으로 분류가 이루어져서 기원이 확인된 S.

데이터처리

얻어진 형개의 염기서열들을 NCBI에서 Blast하였으며, 계통수 (Phylogenetic Tree)를 그리기 위하여 Bioedit 프로그램으로 식물체와 한약재의 염기서열들을 편집한 다음, ClustalX 프로그램으로 염기서열을 정렬하였다. 계통수는 MEGA4 프로그램을 사용하여 구축하였다.

성능/효과

4). Bootstrap 분석 결과, 14~100%의 bootstrap value가나타나 계통수가 전체적으로 안정적이지 않았다. 이 계통수에서 형개 (S.
ITS 계통수의 유용성을 확인하기 위하여 ITS 유전자 염기서열을 이용하여 계통수를 그리고, trnL-F 계통수와 비교해 보 았다. ITS유전자 염기서열의 정렬 결과, 형개와 가장 가까운 종은 같은 Schizonepeta 속 (genus) S. multifida이었고 다른속 (genus) 식물로는 Bupleurum falcatum, Agastache foeniculum, Glechoma hederacea 식물들이 가장 형개와 가까왔다. Nucleotide divergence는 각각 1.
TrnL 유전자 intron의 G+C content는 34.92%, trnL 유전자의 3' exon이 44.0%, trnL 유전자와 trnF exon 사이의 intergenic 영역이 36.03%, 전체 trnL-F 영역은 35.86% 이었다(Fig. 2).
TrnL-F 염기서열 분석 결과 형개와 가장 가까운 종은 Schizonepeta multifida와 Agastache rugosa이었고, nucleotide divergence와 염기 차이는 각각 1.4%, 10 bp 그리고 4.4%, 30 bp이었다 (Table 2). 다음으로 형개와 가까운 종들은 모두 NCBI Taxonomy browser에서 꿀풀과 (Lamiaceae)의 속 (genus)들이었다.
계통학적 분석은 Neighbor-Joining method로 수행되었고 인삼 (Panax ginseng)을 외군 (outgroup)으로 사용하였는데 이 계통수는 꿀풀과 (Lamiaceae)의 Nepetoideae 아과 (subfamily), Mentheae족 (tribe)에 속하는 여러 속 (genus)들로 구성되었다 (Fig. 4). Bootstrap 분석 결과, 14~100%의 bootstrap value가나타나 계통수가 전체적으로 안정적이지 않았다.
형개의 trnL-F 염기서열은 Agastache rugosa trnL-F (EU244612, Identities = 818/849 (96%)), Agastache urticifolia trnL-F (AY570452, Identities = 819/851 (96%)), Lepechinia chamaedryoides trnL-F (AY570459, Identities =816/851 (95%)), Lepechinia lancifolia trnL-F (DQ667492, Identities = 812/853 (95%))와 유사한 것으로 나타났다. 그러나 같은 속에 존재한 Schizonepeta multifida 와는 80%로써 오히려 상동성이 매우 떨어지는 것을 확인할 수 있었다 (Table 2).
4%, 30 bp이었다 (Table 2). 다음으로 형개와 가까운 종들은 모두 NCBI Taxonomy browser에서 꿀풀과 (Lamiaceae)의 속 (genus)들이었다.
ITS 유전자 염기서열을 이용한 계통수는 trnL-F 염기서열을 이용한 계통수와 비슷한 결과를 보이고 있다. 두 계통수에서 Glechoma 속과 Bupleurum 속은 같은 clade를 형성하였고, Dracocephalum 속과 Hyssopus 속은 같은 clade를 형성했다. 형개는 이 두 clade와 Agastache 속 clade와 가장 가까웠다 (Fig.
multifida)가 속한 group은 Hyssopus, Lallemantia, Dracocephalum속 (genus)이 속한 group과 가장 가까운 sister group (자매군)임을 알 수 있고, 이 때 bootstrap value는 100%를 나타내었다. 또한, Schizonepeta 속 (genus)과 Hyssopus, Lallemantia, Dracocephalum 속 (genus)이 속하는 group은 Agastache (배초향) 속 (genus)과 가까운 sister group (자매군)이었으며, 이 때 bootstrap value는 47%에 불과하였다.
반면에 ITS의 경우에는 Schizonepeta multifida ITS (DQ667313.1, Identities = 719/726(99%)), Agastache gana ITS (AJ421000, Identities = 765/805 (95%)), Agastache barberi ITS (AJ421001, Identities = 743/781 (95%)), Dracocephalum kotschyi ITS (AJ420998, Identities = 741/794 (99%)), Agastache urticifolia ITS (DQ667247, Identities = 682/722 (94%))와 유사하였으며, 반면에 Schizonepeta multifida와는 총 800개 base 중에서 7개만 서로 달라 상동성이 trnL-F와는 달리 매우 높은 것으로 나타났다 (Table 3).
tenuifolia)는 Asterids 아강 (subclass), Lamiales 목 (order), 꿀풀과 (Lamiaceae)로 분류되고 있다. 본 연구에서 형개의 trnL-F 계통수와 ITS 계통수 결과가 유사한 결론을 도출하였는데 이것은 DNA 염기서열을 근거로 한 NCBI Taxonomy browser의 분류와 일치하고 있었다.
시중에서 판매된 한약재 형개의 기원을 확인하기 위하여 형태학적으로 기원이 분명한 형개 (Schizonepeta tenuifolia) 2종과, 국내외에서 수집한 중국산 13종 그리고 국내에서 수집한 국내산 11종을 대상으로 총 26종의 형개를 이용하여 trnL-F 염기서열을 분석한 결과, Fig. 6에서 보는바와 같이 모두 동일한 염기서열로 나타내어 정확한 기원에 의한 형개의 유통에는 문제가 없는 것으로 보인다 (100% 일치). 그러나 형개는 중국 북부지방이 원산지이며, 한국에 자생하지 않았던 식물로서 형태적으로 향유, 곽향등과 유사하며, 종에는 Schizonepeta tenuifolia, Schizonepeta multifida가 보고되어 있고, 대한약전에서는 Schizonepeta tenuifolia 만 한약재로 사용하도록 규정 되어 있다.
Bootstrap 분석 결과, 14~100%의 bootstrap value가나타나 계통수가 전체적으로 안정적이지 않았다. 이 계통수에서 형개 (S. tenuifolia)와 말들깨 (S. multifida)가 속한 group은 Hyssopus, Lallemantia, Dracocephalum속 (genus)이 속한 group과 가장 가까운 sister group (자매군)임을 알 수 있고, 이 때 bootstrap value는 100%를 나타내었다. 또한, Schizonepeta 속 (genus)과 Hyssopus, Lallemantia, Dracocephalum 속 (genus)이 속하는 group은 Agastache (배초향) 속 (genus)과 가까운 sister group (자매군)이었으며, 이 때 bootstrap value는 47%에 불과하였다.
2). 형개 (Schizonepeta tenuifolia.)의 trnL-F 염기서열을 NCBI에서 Blast한 결과, 형개의 trnL-F 염기서열이 NCBI에 등록되어 있지 않음을 확인하였고, 형개 trnL-F 염기서열을 NCBI에 등록하였다 (Accession number EU186386).
3). 형개의 ITS 염기서열을 NCBI에서 Blast하였고, 그 결과, 형개의 ITS 염기서열이 NCBI에 등록되어 있지 않음을 확인하였으며, 본 연구에서 얻어진 형개 ITS 염기서열을 trnL-F와 같이 NCBI에 등록 하였다 (Accession number EU383034).
따라서 본 연구에서 얻어진 형개 trnL-F 염기서열을 분석한 염기서열을 이용하여 NCBI에 보고 된 식물들과의 상동성을 조사하였다. 형개의 trnL-F 염기서열은 Agastache rugosa trnL-F (EU244612, Identities = 818/849 (96%)), Agastache urticifolia trnL-F (AY570452, Identities = 819/851 (96%)), Lepechinia chamaedryoides trnL-F (AY570459, Identities =816/851 (95%)), Lepechinia lancifolia trnL-F (DQ667492, Identities = 812/853 (95%))와 유사한 것으로 나타났다. 그러나 같은 속에 존재한 Schizonepeta multifida 와는 80%로써 오히려 상동성이 매우 떨어지는 것을 확인할 수 있었다 (Table 2).

후속연구

최근 유전자의 염기서열을 이용하여 형태적인 분류방법을 보완하고자 많은 실험들이 진행되고 있는데 DNA 염기서열을 이용하여 식물을 감별할 때, 식물에만 특징적으로 존재하는 기관인 엽록체 DNA와 rDNA를 많이 사용하고 있다. 그 중에서 trnL-F, ITS 영역을 많이 이용 하고 있어 (Lang et al., 2006), 형개도 trnL-F 과 ITS 영역 염기서열을 결정하고, 이 염기서열들을 이용하여 기원식물을 확인하므로서 시중에서 유통되고 있는 한약재 형개가 S. tenuifolia 종(species) 진품이 맞는지 확인할 필요가 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	한약재 형개의 정의는 무엇인가?	한약재 형개(Schizonepetae Spike)는 대한약전에 의하면 한국식물명 형개 (Schizonepeta tenuifolia Briquent (꿀풀과 Labiatae))의 꽃대를 한약재로 사용하는 것으로 정의되어 있으며, 중국과 일본에서도 동일하게 해표약으로 적용되어 한의약품 원료로 현재 유통되고 있다. 형개는 따뜻한 성질을 가지고 있어서 발한 (땀, diaphoresis)을 유발시키고 (Lu et al.
	DNA 염기서열을 이용하여 식물을 감별할 때 많이 이용하는 영역은 무엇인가?	최근 유전자의 염기서열을 이용하여 형태적인 분류방법을 보완하고자 많은 실험들이 진행되고 있는데 DNA 염기서열을 이용하여 식물을 감별할 때, 식물에만 특징적으로 존재하는 기관인 엽록체 DNA와 rDNA를 많이 사용하고 있다. 그 중에서 trnL-F, ITS 영역을 많이 이용 하고 있어 (Lang et al., 2006), 형개도 trnL-F 과 ITS 영역 염기서열을 결정하고, 이 염기서열들을 이용하여 기원식물을 확인하므로서 시중에서 유통되고 있는 한약재 형개가 S.
	형개는 어디에 사용되는가?	한약재 형개(Schizonepetae Spike)는 대한약전에 의하면 한국식물명 형개 (Schizonepeta tenuifolia Briquent (꿀풀과 Labiatae))의 꽃대를 한약재로 사용하는 것으로 정의되어 있으며, 중국과 일본에서도 동일하게 해표약으로 적용되어 한의약품 원료로 현재 유통되고 있다. 형개는 따뜻한 성질을 가지고 있어서 발한 (땀, diaphoresis)을 유발시키고 (Lu et al., 2002), 감기와 발진 (skin eruptions), 알러지 (allergic dermatitis), 천식 (eczema) 및 건선 (psoriasis) 등에 사용된다 (Chang and But, 1986; Guo et al., 1997; Zhu, 1998).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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