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문제 정의
- 이를 위하여 특정 세포나 주변조건을 인식하여 목적 유전자를 발현시키는 artificial gene circuit을 만드는 연구도 활발히 이루어지고 있다(5, 6). 본 연구진은 T3SS를 이용한 외래단백질 분비 (secretion) 가능성을 살펴보기 위하여, 살모넬라균의 effector 단백질과 모델 단백질인 lipase와의 fusion protein을 제작하고 이를 균주 외부로 분비하는 연구를 수행하였다.
제안 방법
- typhimurium SL1344 균주를 37°C, 250 rpm에서 stationary phase에 이를 때 까지 배양한 후, 배양액을 10, 000 rpm에서 10분간 원심분리 한다 Lipase 활성도 분석을 위한 기질로 p-nitrophenyl decanoate# 사용하였다. Acetonitrile 용액에 10 mM 의 농도로 /?-nitrophenyl decanoate 를 용해시킨 후에 ethanol, 50 mM Tris-HCl 용액과 1 : 4 : 95 (10 mM /7-nitrophenyl decanoate : ethanol : 50 mM Tris-HCl) 의 비율로 혼합하여 기질용액을 제작하였다(8・11). 배양 상등액 0.
- PCR은 Expand high-fidelity PCR system (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)을 이용하여 수행하였으며, 본 연구에서 사용한 PCR primer들은 Table 1 에 정리되어 있다 SPI-1 의 effector sptP, slrP 유전자의 PCR primer 는 Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2의 염기서열을 바탕으로 제작하였다 华沪유전자의 프로모터와 5■말단 474 bp를 PCR 증폭하였고 tliA, estA-P 유전자도 PCR로 증폭하였다. sptP 유전자와 tliA, estA-P 유전자를 overlapping PCR을 수행하여 sptP-tliA, sptP-estA-P fiision 유전자들을 제작하였다(Fig.
- TliA 단백질의 분비에 효과적이었던 SptP 단백질의 N-말단부분이 다른 lipase의 분비에도 효율적인지 확인하기 위하여 SptP 단백질과 EstA-P lipase와의 fusion 단백질을 제작하였다. S.
- 2). slrP 유전자의 프로모터와 N■말단 573 bp 를 PCR 증폭하여 tliA 유전자와 overlapping PCR을 수행하여 slrP-tliA fusion 유전자를 제작하였曰⑺. Fusion 유전자들은 pGEM-T 벡터에 클로닝 하여, S.
- sptP 유전자와 tliA, estA-P 유전자를 overlapping PCR을 수행하여 sptP-tliA, sptP-estA-P fiision 유전자들을 제작하였다(Fig. 2). slrP 유전자의 프로모터와 N■말단 573 bp 를 PCR 증폭하여 tliA 유전자와 overlapping PCR을 수행하여 slrP-tliA fusion 유전자를 제작하였曰⑺.
- sptP 유전자의 5-말단 474 bp를 프로모터와 함께 tliA 유전자와 overlapping PCR을 수행하여 sptP-tliA fusion 유전자를 제작百였으며, slrP 유전자의 5■말단 573 bp를 프로모터와 함께 tliA 유전자와 overlapping PCR을 수행하여 slrP-tliA fusion 유전자를 제작하였다 (Fig. 2). 제작한 sptP-tliA fusion 시스템은 sptP 유전자의 프로모터에 의하혀 발현이 조절되며, 활성화되면 SptP 단백질의 N-말단 158 아미노산과 TliA 단백질이 fusion된 SptP-TliA fusion 단백질을 발현한다.
- 단백질을 동물세포내부로 직접 주입할 수 있는 살모넬라균 주의 T3SS를 활용하여 모델 단백질인 lipase를 세포 외부로 분비하는 시스템을 제작하였다. T3SS의 effector 단백질인 SlrP, SptP의 N-말단부분과 lipase를 fiision하였다 Lipase 분비실험의 결과 S.
- 다만 몇 몇 effector 단백질의 N-말단 부분을 외래단백질의 N-말단부분에 fusion할 경우 해당 단백질이 분비됨이 보고되어져 있다(12). 본 연구진은 effector 단백질 중 SptP오} SlrP의 N-말단 각 158 아미노산 서열과 191 아미노산서 열을 Pseudomonas fluorescens 유래 TliA lipase 오} fusion하였다
- 보고되어졌다(13). 본 연구진은 재조합 S. typhimurium SL1344 균주를 stationary phase까지 배양하여 SPI-1 네트워크를 활성화하는 전략을 취하였다 재조합 fosion 단백질 시스템을 테스트하기 위하여, S. typhimurium SL1344, S. typhimurium SL1344 (sptP-tliA), S. typhimurium SL1344 (slrP-tliA) 균주를 stationary phase에 이르도록 배양한 후 lipase 활성도를 측정하였다.
대상 데이터
- 배양을 위하여 Luria-Bertani 배지 (Bacto Tryptone 10 g/L, Bacto yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L) 가 사용되었으며, ampicillin 100 mg/L를 추가하였다.
- 클로닝 등의 일반적인 유전자 조작을 위한 균주로 Escherichia coll TOP 10 균주가 사용되었으며, 유전자 발현 균주로는 Salmonella typhimurium SL1344 균주가 사용되었다. 배양을 위하여 Luria-Bertani 배지 (Bacto Tryptone 10 g/L, Bacto yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L) 가 사용되었으며, ampicillin 100 mg/L를 추가하였다.
- 5 M EDTA용액 2 卩L를 주입하여 반응을 종료하였다. 활성도는 생산물인 p-nitrophen이를 405 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
성능/효과
- S. typhimurium SL1344 (sptP-estA-P)를 배양하여 lipase 분비 실험을 수행한 결과, S. typhimurium SL1344 균주와 비슷한 수준의 lipase 활성도를 얻을 수 있었다. 본 실험 결과로부터 SptP 단백질의 N-말단 부분이 모든 단백질 혹은 lipase의 분비에 효율적이지 않고, TliA라는 특정 lipase 에 높은 효율을 보임을 확인할 수 있었다
- SlrP-TliA fusion 단백질을 포함한 S. typhimurium SL1344 {slrP-tliA) 재조합균주는 일반 S. typhimurium SL1344 균주와 비슷한 수준의 lipase 활성도를 보여주었지만, S. typhimurium SL1344 (sptP-tliA) 균주는 약 2.6배 증가된 lipase 활성도를 보여주었다(Fig. 3). 본 결과로부터 SlrP, SptP 단백질 중 SptP 단백질과 TliA 단백질을 fusion 하였을 경우 더욱 효율적으로 분비됨을 확인 할 수 있었다.
- 분비하는 시스템을 제작하였다. T3SS의 effector 단백질인 SlrP, SptP의 N-말단부분과 lipase를 fiision하였다 Lipase 분비실험의 결과 S. typhimurium SL1344 (sptP-tliA) 균주의 경우 lipase 활성도가 약 2.6배 증가하는 결과를 얻을 수 있었다. 본 실험결과를 바탕으로 T3SS 에 관한 연구가 더욱 활발히 이루어진다면, T3SS를 신개념 약물전달시스템으로 활용이 가능해 지리라 예상된다.
- 3). 본 결과로부터 SlrP, SptP 단백질 중 SptP 단백질과 TliA 단백질을 fusion 하였을 경우 더욱 효율적으로 분비됨을 확인 할 수 있었다.
- typhimurium SL1344 균주와 비슷한 수준의 lipase 활성도를 얻을 수 있었다. 본 실험 결과로부터 SptP 단백질의 N-말단 부분이 모든 단백질 혹은 lipase의 분비에 효율적이지 않고, TliA라는 특정 lipase 에 높은 효율을 보임을 확인할 수 있었다
- 본 연구를 통하여 기존의 protein secretion system과는 다른 분비 기작을 가지고 있는 T3SS를 통하여 효과적으로 단백질을 세포 외부로 분비시킬 수 있음을 확인하였다. T3SS를 활용하면 동물세포 내부로 직접 단백질을 직접 분비할 수 있으므로 이를 활용한 신개념 약물전달시스템 및 치료제의 개발에 활용될 수 있으리라 예상된다.
후속연구
- T3SS를 활용하면 동물세포 내부로 직접 단백질을 직접 분비할 수 있으므로 이를 활용한 신개념 약물전달시스템 및 치료제의 개발에 활용될 수 있으리라 예상된다. T3 SS를 약물전달시스템으로 활용하기 위하여 후속적인 연구들이 수행되어야 한다 우선 현재 분비된 SptP-TliA fusion protein이 실제로 균주외부로 분비된 것인지 확인하여보아야 할 것이며, lipase 활성을 나타내지 않은 SlrP-TliA, SptP-EstA-P fusion protein들의 활성도 확인하여 보아야 한다. 또한 일반적인 신호염기서열과 달리 T3SS effector 단백질의 N-말단 부분은 분비과정에서 제거되는 기작이 없으므로 fiision한 N-말단 부분과 목적 단백질과의 구조적 융합성이 중요할 것이다.
- 확인하였다. T3SS를 활용하면 동물세포 내부로 직접 단백질을 직접 분비할 수 있으므로 이를 활용한 신개념 약물전달시스템 및 치료제의 개발에 활용될 수 있으리라 예상된다. T3 SS를 약물전달시스템으로 활용하기 위하여 후속적인 연구들이 수행되어야 한다 우선 현재 분비된 SptP-TliA fusion protein이 실제로 균주외부로 분비된 것인지 확인하여보아야 할 것이며, lipase 활성을 나타내지 않은 SlrP-TliA, SptP-EstA-P fusion protein들의 활성도 확인하여 보아야 한다.
- T3 SS를 약물전달시스템으로 활용하기 위하여 후속적인 연구들이 수행되어야 한다 우선 현재 분비된 SptP-TliA fusion protein이 실제로 균주외부로 분비된 것인지 확인하여보아야 할 것이며, lipase 활성을 나타내지 않은 SlrP-TliA, SptP-EstA-P fusion protein들의 활성도 확인하여 보아야 한다. 또한 일반적인 신호염기서열과 달리 T3SS effector 단백질의 N-말단 부분은 분비과정에서 제거되는 기작이 없으므로 fiision한 N-말단 부분과 목적 단백질과의 구조적 융합성이 중요할 것이다. 즉, effector^] N-말단과 목적 단백질이 서로의 3차원 단백질 구조를 간섭하지 않으며, 목적 단백질의 활성도를 저하시키지 않아야 한다.
- 6배 증가하는 결과를 얻을 수 있었다. 본 실험결과를 바탕으로 T3SS 에 관한 연구가 더욱 활발히 이루어진다면, T3SS를 신개념 약물전달시스템으로 활용이 가능해 지리라 예상된다.
- 즉, effector^] N-말단과 목적 단백질이 서로의 3차원 단백질 구조를 간섭하지 않으며, 목적 단백질의 활성도를 저하시키지 않아야 한다. 이를 위하여 본 연구에서 실험한 SlrP, SptP 이외에 다양한 effector 단백질들을 테스트하여보아야 할 것이다.
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