유류와 중금속으로 오염된 토양에서 분리한 미생물의 Pb와 Cd 생물흡착 특성 Biosorption of Pb and Cd by Indigenous Bacteria Isolated from Soil Contaminated with Oil and Heavy Metals원문보기
유류 및 중금속으로 오염된 토양에서 Pb 및 Cd에 내성을 갖는 미생물을 분리하여 미생물 내 중금속 흡착 특성을 조사하였다. 분리한 토착미생물의 Pb 및 Cd의 흡착특성과 흡착에 영향을 미치는 요인 중에 생장단계, 중금속 농도, 생물량, pH, 온도에 따른 영향을 비교하였다. 또한 흡착등온식을 적용하여 중금속의 흡착용량과 흡착강도를 알아보았다. 낮은 중금속 초기 농도와 높은 생물량에서 높은 중금속 제거 효율을 가지며 중금속 마다 다른 흡착 효율을 보여 주었다. 흡착 효율은 미생물 생장 말기, pH 5~9 조건에서 최적의 효율을 나타내었으나, 25~$35^{\circ}C$에서 온도 변화에 따른 영향은 미미하였다. 생물흡착 과정을 Langmuir 등온 흡착식에 적용하면, 이론적 최대 흡착량은 Pb와 Cd에 대해서 각각 62.11과 192.31 mg/g로 나타났고, $R^2$가 0.71과 0.98로 계산되었다. Cd는 세포 표면의 단일 층에 단분자 흡착에 의한 생물흡착이 진행되었으나, Pb는 미생물 대사 작용을 통한 세포 내로의 축적 작용과 미생물 내 음이온과의 반응에 의한 침전물 형성작용 둥을 통하여 생물흡착이 진행된 것으로 판단된다.
유류 및 중금속으로 오염된 토양에서 Pb 및 Cd에 내성을 갖는 미생물을 분리하여 미생물 내 중금속 흡착 특성을 조사하였다. 분리한 토착미생물의 Pb 및 Cd의 흡착특성과 흡착에 영향을 미치는 요인 중에 생장단계, 중금속 농도, 생물량, pH, 온도에 따른 영향을 비교하였다. 또한 흡착등온식을 적용하여 중금속의 흡착용량과 흡착강도를 알아보았다. 낮은 중금속 초기 농도와 높은 생물량에서 높은 중금속 제거 효율을 가지며 중금속 마다 다른 흡착 효율을 보여 주었다. 흡착 효율은 미생물 생장 말기, pH 5~9 조건에서 최적의 효율을 나타내었으나, 25~$35^{\circ}C$에서 온도 변화에 따른 영향은 미미하였다. 생물흡착 과정을 Langmuir 등온 흡착식에 적용하면, 이론적 최대 흡착량은 Pb와 Cd에 대해서 각각 62.11과 192.31 mg/g로 나타났고, $R^2$가 0.71과 0.98로 계산되었다. Cd는 세포 표면의 단일 층에 단분자 흡착에 의한 생물흡착이 진행되었으나, Pb는 미생물 대사 작용을 통한 세포 내로의 축적 작용과 미생물 내 음이온과의 반응에 의한 침전물 형성작용 둥을 통하여 생물흡착이 진행된 것으로 판단된다.
Indigenous bacterium which shows a tolerance to high metal toxicity was isolated from soil concomitantly contaminated with oil and heavy metals. The characteristics of the bacterium for Pb and Cd biosorption was investigated under the various experimental conditions such as bacterial growth phase, t...
Indigenous bacterium which shows a tolerance to high metal toxicity was isolated from soil concomitantly contaminated with oil and heavy metals. The characteristics of the bacterium for Pb and Cd biosorption was investigated under the various experimental conditions such as bacterial growth phase, the initial metal concentration, the input biomass amount, temperature and pH. The Langmuir adsorption isotherm modeling was described to know the capacity and intensity of biosorption. The low initial concentration of heavy metals and high biomass has a maximum heavy metal removal efficiency, but biosorption capacity of Pb and Cd has different values. Biosorption efficiency was highest in the end of the microbial growth stage and under pH 5~9 condition, but was less affected by temperature variation of 25~$35^{\circ}C$. The maximum biosorption capacity for Pb and Cd was 62.11 and 192.31 mg/g, respectively and each $R^2$ was calculated as 0.71 and 0.98 by applying Langmuir isothermal adsorption equation. Biosorption for Cd was considered as monomolecular adsorption to single layer on the surface of cells, whereas biosorption for Pb was considered as accumulation process into the cell by the microbial metabolism and precipitation reaction with anion of bacteria.
Indigenous bacterium which shows a tolerance to high metal toxicity was isolated from soil concomitantly contaminated with oil and heavy metals. The characteristics of the bacterium for Pb and Cd biosorption was investigated under the various experimental conditions such as bacterial growth phase, the initial metal concentration, the input biomass amount, temperature and pH. The Langmuir adsorption isotherm modeling was described to know the capacity and intensity of biosorption. The low initial concentration of heavy metals and high biomass has a maximum heavy metal removal efficiency, but biosorption capacity of Pb and Cd has different values. Biosorption efficiency was highest in the end of the microbial growth stage and under pH 5~9 condition, but was less affected by temperature variation of 25~$35^{\circ}C$. The maximum biosorption capacity for Pb and Cd was 62.11 and 192.31 mg/g, respectively and each $R^2$ was calculated as 0.71 and 0.98 by applying Langmuir isothermal adsorption equation. Biosorption for Cd was considered as monomolecular adsorption to single layer on the surface of cells, whereas biosorption for Pb was considered as accumulation process into the cell by the microbial metabolism and precipitation reaction with anion of bacteria.
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문제 정의
환경적 요인으로 미생물의 성장과 중금속의 형태에 영향을 미칠 수 있는 인자들이 포함되는데 온도, pH, 산소, 물, 영양분, 토양의 특성 등이 이에 해당한다(Aksu, 2001). 이 연구에서는 중금속에 내성을 갖고 흡착에 활성을 나타내는 미생물을 분리하여, 분리한 토착미생물의 흡착특성과 생장시간, 초기농도, 생물량, pH, 온도가 중금속 흡착에 미치는 영향을 파악하기 위한 실험을 실시하였다.
가설 설정
15). Langmuir 등온 흡착식은 미생물 표면에 중금속 분자가 단일 층으로 포화되고, 모든 위치에서 동일한 흡착 에너지를 가진다고 가정 하에 만들어진 것이다. Freundlich 등온 흡착식은 이론적인 배경을 가지고 유도된 Langmuir 등온 흡착식과는 달리 경험적으로 구하여진 실험식이라는 한계를 가지나 불균일한 흡착에너지를 갖는 흡착제의 경우 Freundlich 등온 흡착식이 더 적합하다(Ruthven, 1984).
제안 방법
pH에 따른 흡착효율 실험을 위해 용액의 pH를 HC1 과 NaOH를 이용하여 각각 3, 5, 7, 9로 조절하였으며, 16시간 배양한 미생물량을 lg/L 주입하고, 초기농도 Pb 100mg/L와 Cd 10mg/L 용액이 되도록 제조하였다. 기타 흡착실험 조건 및 분석과정은 2.
2절과 동일하다. 미생물에 의하지 않은 순수한 pH의 영향을 알아보기 위하여 비교시료로 미생물 대신 증류수를 첨가한 용액에 대해서도 마찬가지 방법으로 실험을 수행하였다.
미생물의 생장 진행 속도를 파악하기 위하여 미생물을 배양하면서 두 시간마다 배양액을 채취하여 UV-vis spectrophotometer®- 이용하여 600 nm의 파장에서 용액의 광밀도(optical density)를 측정하였다. 측정 결과를 바탕으로 미생물을 LB broth 배지 500 mL이 들어 있는 Nalgen bottle에 접종 후 각각 8, 10, 14, 16, 24시간이 경과한 후 미생물을 원심분리하고 3회 증류수로 세척 후 60℃, 2시간 조건에서 건조시켰다.
3회 계대배양(subculture)시켜 5mL 씩 취해 500 mL의 LB 액체배지에서 24시간 배양하고 원심분리 후 토착 미생물을 분리하였다. 분리된 미생물은 16s rRNA 분석을 통하여 동정을 실시하였다.
측정 결과를 바탕으로 미생물을 LB broth 배지 500 mL이 들어 있는 Nalgen bottle에 접종 후 각각 8, 10, 14, 16, 24시간이 경과한 후 미생물을 원심분리하고 3회 증류수로 세척 후 60℃, 2시간 조건에서 건조시켰다. 생장한 시간이 상이한 분리된 미생물에 Pb와 Cd의 농도가 각각 100 과 10 mg/L가 되고, 토착 미생물량은 lg/I가 되도록 용액을 제조하였다. 이 용액 50mL을 항온 진탕 배양기에서 25℃, 150rpm의 조건으로 교반하였고, 10 분 간격으로 1시간 동안 시료를 채취하여 3, 000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 취해 2 pm 크기로 필터링한 후에 원자흡광분광기 (AAS, Atomic Absorption Spectrometer, Perkin Elmer; AAnalyst 100)로 용액중 남아있는 Pb와 Cd의 농도를 측정하였다.
온도에 따른 흡착효율 파악을 위해 용액의 온도를 항온 진탕 배양기를 이용하여 25℃와 35P로 각각 맞추어 Pb lOOmg/L와 Cd 10mg/L가 되고, 1g/L의 16시간 배양한 미생물 용액이 되도록 하여 총 부피 50mL 의 혼합 용액을 만들었다. 기타 흡착실험 조건 및 분석과정은 2.
유류 및 중금속으로 오염된 토양에서 Pb 및 Cd에 내성을 갖는 토착 박테리아를 분리하기 위하여 LB 고체 배지에 Pb와 Cd 를 1,000 mgL를 투입하였고, 이러한 고농도의 중금속 농도에 내성을 갖고 생존한 미생물을 분리하였다(Fig. 1). 분리된 미생물은 SPb-1 이라 명명하였고, 16s rRNA로 분석한 결과 Firmicutes 에 속하는 Bacillus thruingiensis NCIMB와 99.
생장한 시간이 상이한 분리된 미생물에 Pb와 Cd의 농도가 각각 100 과 10 mg/L가 되고, 토착 미생물량은 lg/I가 되도록 용액을 제조하였다. 이 용액 50mL을 항온 진탕 배양기에서 25℃, 150rpm의 조건으로 교반하였고, 10 분 간격으로 1시간 동안 시료를 채취하여 3, 000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 취해 2 pm 크기로 필터링한 후에 원자흡광분광기 (AAS, Atomic Absorption Spectrometer, Perkin Elmer; AAnalyst 100)로 용액중 남아있는 Pb와 Cd의 농도를 측정하였다.
초기 Pb 및 Cd 농도에 따른 흡착효율 측정을 위해 Pb 농도는 PbCl2 (Junsei)를 사용하여 50, 100, 200, 400, 800 mg/L로 조절하였고, Cd 농도는 CdCl2 (Aldrich)를 이용하여 5, 10, 20, 50, 100, 200, 400mg/L가 되게 하였다. 다른 조건으로 16시간 배양한 lg/L 미생물량, 최종 용액의 부피는 50mL이 되게 조절하였다.
측정 결과를 바탕으로 미생물을 LB broth 배지 500 mL이 들어 있는 Nalgen bottle에 접종 후 각각 8, 10, 14, 16, 24시간이 경과한 후 미생물을 원심분리하고 3회 증류수로 세척 후 60℃, 2시간 조건에서 건조시켰다. 생장한 시간이 상이한 분리된 미생물에 Pb와 Cd의 농도가 각각 100 과 10 mg/L가 되고, 토착 미생물량은 lg/I가 되도록 용액을 제조하였다.
대상 데이터
중금속에 내성을 갖는 토착미생물을 분리하기 위하여 인천광역시의 유류 및 중금속으로 오염된 토양을 대상으로 실험을 실시하였다. 채취한 토양시료 5g 에 S차증류수 50mL을 넣고 교반하여 토양이 가라앉을 때까지 기다린 후 상등액 0.
성능/효과
Pb 및 Cd에 내성을 갖는 분리된 토착 미생물은 10분 이내에 흡착이 모두 진행되어, Pb 의 경우 50, 100mg/L인 경우에 90% 의 높은 Pb 제거 효율을 보여주고 있고 lOOmg/L를 초과하는 150, 200, 400, 800mg/L인 경우에는 그 효율이 각각 약 78, 74, 74, 74% 로 나타났다. Cd는 10mg/L 이하의 저농도인 5, 10mg/L에서 62, 81% 의 흡착율을 보였고, 20, 50, 100, 200, 400mg/L의 농도에서는 각각 50, 50, 50, 40, 33% 만이 흡착되는 결과를 나타내었다 (Fig. 6). Cd 의 경우 농도가 낮을 때 흡착 효율은 농도가 높을 때보다 높았으나 미생물 단위 질량에 대한중금속 흡착량이 적게 나타났다(Fig.
7에 나타내었다. Pb 및 Cd에 내성을 갖는 분리된 토착 미생물은 10분 이내에 흡착이 모두 진행되어, Pb 의 경우 50, 100mg/L인 경우에 90% 의 높은 Pb 제거 효율을 보여주고 있고 lOOmg/L를 초과하는 150, 200, 400, 800mg/L인 경우에는 그 효율이 각각 약 78, 74, 74, 74% 로 나타났다. Cd는 10mg/L 이하의 저농도인 5, 10mg/L에서 62, 81% 의 흡착율을 보였고, 20, 50, 100, 200, 400mg/L의 농도에서는 각각 50, 50, 50, 40, 33% 만이 흡착되는 결과를 나타내었다 (Fig.
Pb와 Cd 모두 16시간 이상 생장한 박테리아에서 최대 흡착 효율이 90%와 60%로 나타났고, 초기 중금속농도가 Pb는 100 mgL 이하에서 Cd는 5mg/L 이하에서 최대 흡착 효율이 87%와 80%로 관찰되었다. 생물량은 2g/L 이상에서 Pb와 Cd가 모두 최대 흡착 효율이 92%와 78%이었으며, pH는 5 이상에서 Pb와 Cd의 흡착 효율이 90%와 95%로 최대가 되었다.
9에 나타내었다. Pb와 Cd 모두 초기 생물량이 2g/L 이상일 때 90%와 80%의 최대 흡착율을 가지며 생물량이 증가할수록 흡착율은 증가하는 경향을 보였다.
Pb와 Cd에 내성을 갖는 박테리아를 분리하여 동정한 결과 Bacillus thruingiensis로 확인되었고 SPb-1 으로 명명하였다. 분리한 토착 미생물의 생물흡착 실험 결과로 나타난 최대 제거 효율을 갖는 환경 조건과 흡착 효율은 다음과 같다.
1). 분리된 미생물은 SPb-1 이라 명명하였고, 16s rRNA로 분석한 결과 Firmicutes 에 속하는 Bacillus thruingiensis NCIMB와 99.4% 의상 동성을 가지고 있었다(Fig. 2).
생물량은 2g/L 이상에서 Pb와 Cd가 모두 최대 흡착 효율이 92%와 78%이었으며, pH는 5 이상에서 Pb와 Cd의 흡착 효율이 90%와 95%로 최대가 되었다. Pb 와 Cd가 최적의 흡착을 보이는 온도는 25℃와 35℃ 로 상이하였으며 이때의 효율은 88%와 68%로 나타났다.
Reynolds(1982)에 의하면 온도는 미생물의 활성에 영향을 주는 요소로 미생물이 surface functional group의 형성에 관여하며 온도의 증가로 인해 중금속 이온의 확산이 촉진되어 결합을 활발하게 하여 중금속의 흡착이 더 잘 이루어질 것으로 추측하였다. 이번 연구에서는 Pb의 경우에 2RC에서의 제거 효율이 35℃ 에서의 제거 효율과 비교해 더 높았으나, Cd의 경우에는 반대로 35℃에서의 제거 효율이 25℃보다 높았다(Fig. 12, Fig. 13). 실험한 온도의 범위가 넓지 않았기때문에 온도의 변화에 따른 경향성에 대한 결론은 내리기 어려웠으나, Pb의 경우 25℃에서 제거효율이 더 높았던 것은 실험에 사용한 미생물인 SPb-1 을 배양할 때 배양 조건이 25℃이었기 때문에 생장 과정 중 적응의 결과라고 판단된다.
5에 나타내었다. 토착 박테리아는 배양 후 약 20시간 이후에 정체기(stationary phase)가 나타났으며, 16시간 이상 생장한 박테리아에서 Pb는 90%, Cd는 60%의 높은 흡착 능력을 보였고, 생장단계가 높을수록 흡착율은 증가하는 경향을 가지고 있었다. 그러나 24시간 동안 성장한 박테리아의 흡착율은 Pb의 경우 90%, Cd의 경우 60%로 16시간 동안 성장한 박테리아와 같은 흡착 효율을 보여주어 16시간 이상 생장한 박테리아에서 Pb와 Cd의 최대 생물흡착을 가졌다.
흡착 후 미생물의 생존 여부를 관찰하기 위해 반응 후의 박테리아와 금속이온 혼합 용액 일부를 취해 LB 배지에 접종시킨 결과 미생물은 계속적으로 배양되어 활성이 유지되고 있음을 나타내었다. 이는 주어진 농도에서 금속이온이 박테리아에 치명적인 독성을 일으키지 않음을 나타낸다.
후속연구
분리한 토착 박테리아의 경우에 Cde 세포 표면의 단일 층에 단분자 흡착에 의한 생물흡착이 진행되었으나, Pb는 미생물 대사 작용을 통한 세포 내로의 축적 작용과 세포외 고분자 물질 또는 sulhde나 phosphate 같은 미생물 내 음이온과의 반응에 의한 침전물 형성작용 등을 통하여 생물흡착이 진행된 것으로 판단된다. 이러한 연구 결과는 토양 및 지하수의 중금속(Pb, Cd) 생물흡착 처리 기술에 활용 가능할 것으로 사료된다.
참고문헌 (8)
Aksu, Z. (2001) Equilibrium and kinetic modelling of cadmium(II) biosorption by C. vulgaris in a batch system: effect of temperature. Separation and PurificationTechnol., v.3, p.285-294
Friis, N. and Myers-Keith, P. (1986) Biosorption of uranium and lead by Streptonmyces longwoodensis, Biotechnol. Bioeng., v.28, p.21-28.Scott, J.A. and Palmer, S.J. (1990) Site of cadmium uptake in bacteria used for biosorption. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.33, p.221-225
Lee, H.Y., Min, B.H. and Choi, Y.G. (1999) The cadmium biosorption mechanism in gram negative bacteria, Serratia marcescens. Korean J. Envrion. Agric., v.22(1), p.39-43. (in Korean)
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