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문제 정의
- 본 연구는 농식품의 안전성을 저해하는 대표적인 위해요소인 식중독균을 신속하게 검줄할 수 있는 바이오센서의 개발을 위한 항체 고정화방법을 구명하기 위하여 수행되었다. 임피던스 바이오센서의 검출부는 살모넬라 항체를 이용하여 제작하였으며, 항체의 고정화 방법에 따른 살모넬라균 검출 한계를 측정하는 방법으로 바이오센서의 검출 성능을 평가하였다.
- 본 연구는 농식품의 안전성을 저해하는 대표적인 위해요소인 식중독균을 신속하게 검출할 수 있는 바이오센서의 개발을 위한 항체 고정화방법을 구명하기 위하여 수행되었다. 임피던스 바이오센서의 검출부는 살모넬라 항체를 이용하여 제작하였으며, 항체의 고정화 방법에 따른 살모넬라균 검출 한계를 측정하는 방법으로 바이오센서의 검출 성능을 평가하였다 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
제안 방법
- 분포시켰다. 구체적인 고정화 방법은 우선 NaOH와 멸균된 증류수로 세척한 센서 표면에 dithiobis-succinimide propionate(DSP)/dimethyl sulfoxide(DMSO) 50 pL를 가하여 1시간 반응시켜 센서 표면을 티올화 하였다. 센서 표면에 부착되지 않은 티올기는 DMSO를 이용하여 제거하였다.
- 실험을 위하여 임피던스 바이오센서의 양 전극을 임피던스 측정시스템에 연결하고 PBS 용액으로 1회 세척한 다음 세균이 부착되지 않았을 때의 기준 신호를 측정하였다. 기준 신호 측정후 각각 다른 농도의 살모넬라균 시료를 임피던스 바이오센서에 5분간 반응시키고, 1% Triton-X 100 버퍼로 3회 세척한 다음 살모넬라 세균에 의한 임피던스 변화를 측정하였다.
- 나머지 두 가지 고정화방법은 보다 복잡한 공정을 통하여 항체를 센서의 표면에 고정화시키지만, 항체의 고정화 효율이 높고 검출 부의 수명이 긴 장점을 지니고 있다. 본 연구에서는 흡착법과 같이 사용이 간단하면서 공유결합과 같이 높은 결합력을 지녀 현재 바이오센서 연구에 많이 사용되고 있는 아비딘- 바이오틴 결합 방법과 공유결합을 사용하여 결합력이 매우 강한 SAM 방법을 항체 고정화 방법으로 사용하고 그 결과를 서로 비교하였다. 각각의 항체 고정화 방법은 그림 3과 같은 과정을 통하여 항체를 전극 표면에 부착하였으며, 각 방법의 자세한 설명은 다음과 같다.
- 살모넬라 식중독균 검출을 위한 임피던스형 바이오센서는 서로 맞물리는 형태로 이웃한 두 개의 전극 센서를 기반으로 제작하였다. 살모넬라균은 1~2 ㎛ 정도로 크기가 매우 작기 때문에 전극 센서가 높은 검출 감도를 갖도록 MEMS 공정을 이용하여 마이크로 단위의 전극을 개발하였다.
- 살모넬라균 검출 실험은 각각 다른 농도의 살모넬라균에 대한 임피던스 바이오센서의 신호를 분석하는 방식으로 수행하였다. 실험을 위하여 임피던스 바이오센서의 양 전극을 임피던스 측정시스템에 연결하고 PBS 용액으로 1회 세척한 다음 세균이 부착되지 않았을 때의 기준 신호를 측정하였다.
- 살모넬라균은 1~2 ㎛ 정도로 크기가 매우 작기 때문에 전극 센서가 높은 검출 감도를 갖도록 MEMS 공정을 이용하여 마이크로 단위의 전극을 개발하였다. 개발된 전극은 폭 10 ㎛, 길이 990 fan, 그리고 감지부 면적 3 mm2 이며, 200개의 맞물린 전극가지 쌍으로 이루어져 있다.
- 실험을 위하여 임피던스 바이오센서의 양 전극을 임피던스 측정시스템에 연결하고 PBS 용액으로 1회 세척한 다음 세균이 부착되지 않았을 때의 기준 신호를 측정하였다. 기준 신호 측정후 각각 다른 농도의 살모넬라균 시료를 임피던스 바이오센서에 5분간 반응시키고, 1% Triton-X 100 버퍼로 3회 세척한 다음 살모넬라 세균에 의한 임피던스 변화를 측정하였다.
- 바이오센서의 바탕이 되는 전극 제작 과정은 다음과 같다. 우선 유리 웨이퍼 위에 감광물질(Photoresist)을 도포하고, 여기에 패턴 틀(Mask)를 이용하여 미세전극의 모양을 제작하였다 이어서 유리와 금 사이의 접착력 증가를 위해 50 nm 두께의 크롬(Cr) 층을 형성시킨 다음 증착 공정을 이용하여 100 nm 두께의 금 층을 형성시켰다. 바이오센서의 감지부인 미세전극 부위를 제외한 전극의 나머지 영역은 에폭시를 도포하여 절연시켰다.
- 이로 인하여 살모넬라균 검출이 방해 받거나, 살모넬라균이 없더라도 간섭물질의 부착으로 인한 임피던스 신호 증가 현상이 발생할 가능성이 크다. 이를 해결하기 위하여 비선택적 반응을 줄여주는 물질인 Blocker BSA(Pierce, USA)를 1.0 %씩 시료에 첨가하였고 살모넬라균의 농도가 불규칙하게 증가하는 시료 세트(Control, 102 *, 104 S, . 106, 107 CFU/mL) 를 이용하여 임피던스 신호의 변화를 측정하였다.
- 일련의 농도(102~109 CFU/mL)로 이루어진 한 세트의 살모넬라균 검출에 사용된 임피던스 바이오센서는 센서 표면을 재생 버퍼를 이용하여 부착된 세균만을 제거한 후, 검출 부를 재생 시켜 살모넬라균 검출에 재사용하였다. 바이오센서 검출부 재생 버퍼는 100 mM 읺ycine-HCl(pH 2.
- 임피던스 바이오센서 항체 고정화방법의 살모넬라균 검출 효과 검증은 각각의 고정화방법으로 제작된 바이오센서를 이용하여 nf_io9 CFU/mL의 살모넬라균을 검출한 다음, 바이오센서의 표면을 전자현미경으로 확대 촬영한 영상을 분석하는 방법으로 수행하였다. 전자현미경 분석을 위하여 각각 다른 농도의 살모넬라균 시료를 임피던스 바이오센서에 5분간 반응시키고, PBS 버퍼로 3회 세척하여 항체에 부착되지 않은 살모넬라 세균을 씻어 낸 다음, 센서를 건조하여 영상을 촬영하는 방법으로 수행하였다.
- 임피던스 바이오센서는 위의 임피던스 센서의 전극 표면에 살모넬라균을 검출할 수 있는 분자식별부를 형성시킴으로써 제작하였다. 바이오센서의 표면에 분자식 별부를 형성시키기 위해서는 항체를 센서에 고정하여야 하는데 항체를 고정하는 방법은 항체의 결합 방법에 따라 몇 가지로 나눌 수 있다.
- 임피던스 바이오센서의 검출부는 살모넬라 항체를 이용하여 제작하였으며, 항체의 고정화 방법에 따른 살모넬라균 검출 한계를 측정하는 방법으로 바이오센서의 검출 성능을 평가하였다 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 임피던스 바이오센서의 검출부는 살모넬라 항체를 이용하여 제작하였으며, 항체의 고정화 방법에 따른 살모넬라균 검출 한계를 측정하는 방법으로 바이오센서의 검출 성능을 평가하였다.
- 개발된 전극은 폭 10 ㎛, 길이 990 fan, 그리고 감지부 면적 3 mm2 이며, 200개의 맞물린 전극가지 쌍으로 이루어져 있다. 임피던스 센서의 재질은 유리 웨이퍼이며, 식각 공정을 이용하여 전극을 제작하였다. 전극의 재질은 생물체와 접촉하였을 경우 영향이 적고, 화학적으로 항체를 결합시키기 좋은 전극인 금(Au)을 사용하였다.
- 방법으로 수행하였다. 전자현미경 분석을 위하여 각각 다른 농도의 살모넬라균 시료를 임피던스 바이오센서에 5분간 반응시키고, PBS 버퍼로 3회 세척하여 항체에 부착되지 않은 살모넬라 세균을 씻어 낸 다음, 센서를 건조하여 영상을 촬영하는 방법으로 수행하였다.
- 항원-항체 반응에 의해 바이오센서에서 발생하는 미약한 임피던스 신호는 휴대형 임피던스 미세신호 증폭모듈(Bode 100, Omicron Lab, USA)을 이용하여 측정하였다. 임피던스 미세신호 증폭모듈은 바이오센서로부터의 미세 임피던스 신호를 받아들여 증폭하는 입력부와 이를 디지털화 시키는 AAD 변환부' 그리고 변환된 신호를 USB통신 프로토콜을 이용하여 컴퓨터로 전송하는 신호전송부로 구성된다.
대상 데이터
- 살모넬라균은 1~2 ㎛ 정도로 크기가 매우 작기 때문에 전극 센서가 높은 검출 감도를 갖도록 MEMS 공정을 이용하여 마이크로 단위의 전극을 개발하였다. 개발된 전극은 폭 10 ㎛, 길이 990 fan, 그리고 감지부 면적 3 mm2 이며, 200개의 맞물린 전극가지 쌍으로 이루어져 있다. 임피던스 센서의 재질은 유리 웨이퍼이며, 식각 공정을 이용하여 전극을 제작하였다.
- 바이오센서 제작에 필요한 스트렙트아비딘, PBS, Triton X-100, DMSO, DSP 등의 시약은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 살모넬라 항체는 KPL (MD, USA), 바이오틴이 부착된 살모넬라 항체는 ViroStat사 (Portland, ME, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 균주는 생명공학연구원 유전자은행 KCTC (Korea Collection for Type Cultures, Korea)에서 분양받은 Salmonella typhimurium KCTC 12401(5. typhimurium)을사용하였다 분양된 균주는 모두 동결 건조된 상태였으며, 균주에 PBS 완충액 1.0 mL를 첨가한 뒤 Sodium Selenite Agar 에 평판 배양하여 적갈색의 군락을 확인하였다 이와 깉0 선택배지에서 균주를 확인한 후 세균 군락을 Brain Heart Infiision(BHI) 배지에 계대 배양하여 이용하였다. 배양 시 조건은 액체배양의 경우 37℃에서 18~24시간 동안 120 rpm에서 배양하였으며, 평판배양의 경우 37℃ 에서 48시간 배양하였다.
- 실제 식품시료 속에 오염된 살모넬라 식중독균의 검출성능시험은 시중에서 구입한 돼지고기를 대상으로 수행하였다 식품 시료는 시중에서 구입한 돼지고기 목심에 10배 농도의 PBS을 첨가하여 stomacher로 교반한 다음, 0.2 ㎛ 필터로 여과한 추출물에 S. typhimurium을 인위적으로 접종하는 방법으로 준비하였다.
- 임피던스 센서의 재질은 유리 웨이퍼이며, 식각 공정을 이용하여 전극을 제작하였다. 전극의 재질은 생물체와 접촉하였을 경우 영향이 적고, 화학적으로 항체를 결합시키기 좋은 전극인 금(Au)을 사용하였다. 바이오센서의 바탕이 되는 전극 제작 과정은 다음과 같다.
데이터처리
- 5)을 사용하였다. 이러한 방법으로 102~109 CFU/mL의 농도에 대해 검출실험을 3회 반복한 다음, 측정된 임피던스의 평균값을 분석에 이용하였다 임피던스 바이오센서의 세균 검출 성능은 살모넬라균이 접종되지 않은 시료로 측정한 기준신호의 3 반복측정 값으로부터 표준오차(Standard eiror of the mean, SEM) 를구하고, 이 표준오차 값을 3배한 값과 기준신호 값을 더한 값보다 큰 임피던스 신호값을 갖는 세균 농도를 검출한계로 정하였다.
성능/효과
- (1) 아비딘-바이오틴 고정화 방법을 기반으로 한 임피던스 바이오센서의 PBS 시료에 대한 S. typhimurium균 검출 성능은 IO, CFU/mL 이었다.
- (2) SAM 고정화 방법의 경우 아비딘-바이오틴 고정화 방법에 비하여 낮은 농도(IO, CFU/mL)의 세균이 존재하는 시료에서도 높은 임피던스 변화를 나타내어, SAM 고정화 방법은 PBS 버퍼에서 아비딘-바이오틴 방법에 비하여 우수한 검출 성능을 보이는 것으로 조사되었다.
- (3) 식품시료에서의 S. typhimurium 검출 성능은 아비딘- 바이오틴 항체 고정화방법으로 제작한 임피던스 바이오센서의 검출한계는 1018 C2 F3 U* /*m *L *, SAM 항체 고정화 방법으로 제작한 임피던스 바이오센서의 검출한계는 107 CFU/mL으로 PBS 시료 보다는 좋지 않았지만 두 경우 모두 SAM 항체 고정화방법으로 제작한 임피던스 바이오센서의 성능이 더 좋은 것으로 나타났다.
- 9) 역시 시료 내의 세균 농도가 높아짐에 따라 임피던스의 값이 증가하는 경향을 나타내었다. PBS 시료를 이용한 측정 실험과 마찬가지로 저농도의 살모넬라균 검출 성능은 공유결합으로 항체를고정화시킨 SAM 항체 고정화 방법의 측정 감도가 더 좋아 살모넬라 농도 증가에 따른 바이오센서의 임피던스 값 증가가 더 큰 것으로 나타났다. 측정 결과 돼지고기 추출물에서 S.
- typhimurium 검출 성능을 나타내었다. 두 가지 고정화 방법 모두 시료내의 세균 농도가 높아짐에 따라 임피던스의 값이 증가하여 임피던스 바이오센서 검출부의 항체가 살모넬라균을 잘 포획함을 확인할 수 있었다. 임피던스 신호는 세균 농도 증가에 따라 선형적으로 증가하였으며 109 CFU/mL 의 농도에서 그 크기가 급격하게 증가하였다.
- typhimurium 검출 성능을 그림 8과 9에 나타내었다. 아비딘-바이오틴 항체 고정화방법으로 제작한 임피던스 바이오센서의 살모넬라균 검출 결과(Fig. 8)에서 보듯이, 살모넬라 농도에 따라 임피던스의 차이가 통계적으로 유의성이 있어 신호의 변화가 살모넬라균 검출로 인한 것임을 확인할 수 있었다. 아비딘, 바이오틴 고정화 방법을 사용하여 제작한 임피던스 바이오센서의 검출한계는 108 CFU/mL 이었다.
- 않았다. 이에 따라, SAM 고정화 방법을 사용하여 제작한 임피던스 바이오센서의 검출한계는 1W CFU/mL 으로 아비딘-바이오틴 방법에 비해 저농도의 살모넬라균을 검출할 수 있는 것으로 조사되었다. 이는 결합력의 세기가 흡착력에 의한 아비딘- 바이오틴 방법에 비하여 공유결합을 이용하는 SAM 방법이 강하기 때문인 것으로 고려되며, 바이오센서 제작시 전극 표면의 검출물질 고정화 방법으로서 고정화 방법이 가장 적당하다는 Park 등(2003)의 주장과도 일치하는 결과이다.
- 두 가지 고정화 방법 모두 시료내의 세균 농도가 높아짐에 따라 임피던스의 값이 증가하여 임피던스 바이오센서 검출부의 항체가 살모넬라균을 잘 포획함을 확인할 수 있었다. 임피던스 신호는 세균 농도 증가에 따라 선형적으로 증가하였으며 109 CFU/mL 의 농도에서 그 크기가 급격하게 증가하였다. 아비딘-바이오틴 고정화 방법을 사용하여 제작한 임피던스 바이오센서의 검출한계는 CFU/mL 이었다.
- 고.정화방법에 따라 차이가 있었으나, 두 가지 고정화 방법 모두 살모넬라균의 농도에 따라 센서 표면에 포획된 살모넬라균의 수가 비 례적으로 변하여 바이오센서의 검출부가 제대로 작동하는 것을 확인할 수 있었다. 그림 5에 아비딘-바이오틴 고정화방법으로 제작된 바이오센서의 살모넬라균 농도에 따른 검출 실험결과를 나타내었다
- PBS 시료를 이용한 측정 실험과 마찬가지로 저농도의 살모넬라균 검출 성능은 공유결합으로 항체를고정화시킨 SAM 항체 고정화 방법의 측정 감도가 더 좋아 살모넬라 농도 증가에 따른 바이오센서의 임피던스 값 증가가 더 큰 것으로 나타났다. 측정 결과 돼지고기 추출물에서 S. typhimurium의 검출한계는 l(f CFU/mL 으로 PBS 시료의 검출 결과에 비하여 검출 한계가 증가하였다. 이는 식품 시료에 들어있는 식품찌꺼기나 다른 세균에 의한 간섭 때문에 바이오센서 검출부의 살모넬라균에 대한 선택적인 포획 능력이 감소하였고 그로 인해 반복 측정 간 변이가 증가하였기 때문인 것으로 판단된다.
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