금불초 추출물의 항산화 효과 및 산화 스트레스에 대한 신경세포 보호작용 Antioxidant Properties and Protective Effects of Inula britannica var. chinensis Regel on Oxidative Stress-induced Neuronal Cell Damage원문보기
본 연구에서는 금불초(Inula britannica) 추출물의 항산화 효과와 ${H_2}{O_2}$로부터 유도된 SH-SY5Y 신경모세포종의 세포독성에 대한 보호능을 측정하였다. 금불초 지상부위의 70% 메탄올 추출물에 대하여 용매별로 분획을 실시하였고 핵산(Fr.H), 에틸아세테이트(Fr.EA) 및 물(Fr.W) 분획에 대하여 활성을 조사하였다. 분획 중 Fr.W의 폴리페놀/플라보노이드 함량이 가장 높았으며 Fr.W의 총 폴리페놀 함량은 $318.1{\pm}20.6{\mu}g$/mg solid로, Fr.EA 및 Fr.H와 비교하여 각각 약 2.5배, 23.1배 수준이었다. DPPH radical, ABTS radical 및 nitric oxide 소거능 등의 항산화 활성에서도 Fr.W가 가장 높은 활성을 나타내었고 Fr.H는 거의 활성을 나타내지 않았다. Fr.W는 ${H_2}{O_2}$에 의해 유도된 세포사멸에 대하여 62.5 ${\mu}g$/mL 농도에서 현저하게 세포독성을 감소시켰으며 250 ${\mu}g$/mL에서는 77.0%의 세포사멸 억제능을 보였다. Fr.EA는 보호 효과를 나타 내지 않았으며 Fr.H는 오히려 ${H_2}{O_2}$로 인한 세포 독성을 증가시키는 것으로 나타났다. 세포 내 ROS에 대한 영향으로 Fr.W 250 ${\mu}g$/mL 처리시 39.2% 세포내 ROS를 감소시켰으며 Fr.EA는 25 ${\mu}g$/mL에서 26.8%의 세포내 ROS를 소거하였다. 이러한 금불초 Fr.W의 항산화 활성은 ROS에 의해 야기되는 뇌세포 독성에 대한 보호 작용에 공헌할 수 있을 것으로 예상된다.
본 연구에서는 금불초(Inula britannica) 추출물의 항산화 효과와 ${H_2}{O_2}$로부터 유도된 SH-SY5Y 신경모세포종의 세포독성에 대한 보호능을 측정하였다. 금불초 지상부위의 70% 메탄올 추출물에 대하여 용매별로 분획을 실시하였고 핵산(Fr.H), 에틸아세테이트(Fr.EA) 및 물(Fr.W) 분획에 대하여 활성을 조사하였다. 분획 중 Fr.W의 폴리페놀/플라보노이드 함량이 가장 높았으며 Fr.W의 총 폴리페놀 함량은 $318.1{\pm}20.6{\mu}g$/mg solid로, Fr.EA 및 Fr.H와 비교하여 각각 약 2.5배, 23.1배 수준이었다. DPPH radical, ABTS radical 및 nitric oxide 소거능 등의 항산화 활성에서도 Fr.W가 가장 높은 활성을 나타내었고 Fr.H는 거의 활성을 나타내지 않았다. Fr.W는 ${H_2}{O_2}$에 의해 유도된 세포사멸에 대하여 62.5 ${\mu}g$/mL 농도에서 현저하게 세포독성을 감소시켰으며 250 ${\mu}g$/mL에서는 77.0%의 세포사멸 억제능을 보였다. Fr.EA는 보호 효과를 나타 내지 않았으며 Fr.H는 오히려 ${H_2}{O_2}$로 인한 세포 독성을 증가시키는 것으로 나타났다. 세포 내 ROS에 대한 영향으로 Fr.W 250 ${\mu}g$/mL 처리시 39.2% 세포내 ROS를 감소시켰으며 Fr.EA는 25 ${\mu}g$/mL에서 26.8%의 세포내 ROS를 소거하였다. 이러한 금불초 Fr.W의 항산화 활성은 ROS에 의해 야기되는 뇌세포 독성에 대한 보호 작용에 공헌할 수 있을 것으로 예상된다.
The antioxidant properties and protective effects of Inula britannica on ${H_2}{O_2}$-induced SH-SY5Y neuroblastoma cell damage were investigated. A series of solvent fractions, including hexane(Fr.H), petroleum ether, chloroform, ethyl acetate(Fr.EA), and water fraction(Fr.W), were prepa...
The antioxidant properties and protective effects of Inula britannica on ${H_2}{O_2}$-induced SH-SY5Y neuroblastoma cell damage were investigated. A series of solvent fractions, including hexane(Fr.H), petroleum ether, chloroform, ethyl acetate(Fr.EA), and water fraction(Fr.W), were prepared from the 70% methanol extracts of Inula britannica. Fr.W had the highest total contents of phenolics and flavonoids, followed by Fr.EA. The antioxidant properties of the fractions were also evaluated by analyzing their scavenging activities on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radicals, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radicals, and nitric oxide. Fr.W showed the strongest activities in all assays. The concentrations of Fr.W that resulted in 50% reductions of the DPPH and ABTS radicals were 20.7 ${\mu}g$/mL and 39.4 ${\mu}g$/mL, respectively. Fr.W showed the weakest cytotoxic activities on the SH-SY5Y cells, whereas it effectively protected ${H_2}{O_2}$-induced cell death, increasing cell survival by 35.0-77.0% at a concentration range of 62.5-250 ${\mu}g$/mL. In this range, Fr.W also significantly decreased intracellular ROS levels by 34-39%. Overall, the antioxidant properties of Inula britannica can contribute to rescuring neuronal cells from oxidative stress-induced cell injury.
The antioxidant properties and protective effects of Inula britannica on ${H_2}{O_2}$-induced SH-SY5Y neuroblastoma cell damage were investigated. A series of solvent fractions, including hexane(Fr.H), petroleum ether, chloroform, ethyl acetate(Fr.EA), and water fraction(Fr.W), were prepared from the 70% methanol extracts of Inula britannica. Fr.W had the highest total contents of phenolics and flavonoids, followed by Fr.EA. The antioxidant properties of the fractions were also evaluated by analyzing their scavenging activities on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radicals, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radicals, and nitric oxide. Fr.W showed the strongest activities in all assays. The concentrations of Fr.W that resulted in 50% reductions of the DPPH and ABTS radicals were 20.7 ${\mu}g$/mL and 39.4 ${\mu}g$/mL, respectively. Fr.W showed the weakest cytotoxic activities on the SH-SY5Y cells, whereas it effectively protected ${H_2}{O_2}$-induced cell death, increasing cell survival by 35.0-77.0% at a concentration range of 62.5-250 ${\mu}g$/mL. In this range, Fr.W also significantly decreased intracellular ROS levels by 34-39%. Overall, the antioxidant properties of Inula britannica can contribute to rescuring neuronal cells from oxidative stress-induced cell injury.
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문제 정의
기존의 연구를 통하여 glutamate에 의해 유도된 rat의 대뇌피질세포 손상에 대한 금불초 성분의 보호 효과가 발표된 바 있으나(10), 본 연구에서는 금불초의 항산화 효과와 신경세포의 산화적 손상에 대한 보호능 사이의 연관성을 평가하기 위하여 H2O2에 의한 직접적인 산화적 스트레스를 유발하고, 특히 산화적 손상에 민감한 인간 뉴런기원의 신경모세포 모델을 사용하였다.
본 연구에서는 금불초(Inula britannica) 추출물의 항산화 효과와 H2O2로부터 유도된 SH-SY5Y 신경모세포종의 세포독성에 대한 보호능을 측정하였다. 금불 초지상 부위의 70% 메탄올 추출물에 대하여 용매별로 분획을 실시하였고 핵산(Fr.
제안 방법
농도를 달리한 (+)-catechin으로 표준검량곡선을 작성하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
ABTS radical 소거활성은 Dewanto 등(21)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉 ABTS와 potassium persulfate를 각각 7.
H2O2에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포 독성에 대한 금불 초 추출물의 보호효과는 선행 실험(Fig. 5A)상에서 독성을 나타내지 않은 농도 범위의 시료를 처리하여 측정하였다. 각 분획물을 2시간 선처리한 세포에 500 µM H2O2를 2시간 노출시켜 세포독성을 유도하고 정상 성장배지로 교체하여 18시간 배양한 후 세포 생존율의 차이를 평가하였다.
세포 내 ROS 측정은 2',7'-dichlorofluoroescein diacetate(DCFHDA)가 세포 내로 투과된 후 아세틸기가 유리된 2',7'-dichlorofluoroescin(DCFH)의 형태에서 ROS와 반응하여 형광물질을 생성하는 성질을 이용하였다. SH-SY5Y 세포를 96 well plate에 well당 약 8,000 cell이 되도록 접종하여 배양한 후 70-80% confluency가 되었을 때 각금불 초 추출분획을 PBS에 녹여 30분간 처리하였다. 이를 걷어낸 후 10 µM DCFH-DA로 다시 40분간 처리한 후 fluorescence microplate reader(Triad LT, Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA)를 이용하여 excitation 485 nm, emission 535nm에서 형광을 측정하였다 (23).
SH-SY5Y 신경모세포종에 대한 금불 초 추출물 및 H2O2의 독성은 이들을 각각 2시간 처리한 후 다시 성장배지로 환원하여 18시간 후에 측정하였다. 금불 초분 획 중 Fr.
각 분획물을 2시간선 처리한 세포에 500 µM H2O2를 2시간 노출시켜 세포 독성을 유도하고 정상성장배지로 교체하여 18시간 배양한 후 세포생존율의 차이를 평가하였다.
5 mg/mL의 MTT를 약 2시간 처리하여 생성된 MTT formazan을 dimethyl sulfoxide에 용해시켜 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 추출분획 및 H2O2의 단독 처리에 의한 독성은 위의 순서에 따르되 추출분획 또는 H2O2만을 농도별로 2시간 처리하여 분석하였다.
각 추출물의 시료 50 µL에 30 µL의 5% NaNO2를 가하여 5분간 상온에서 방치한 후 60 µL의 2% AlCl3를 더하여 6분간 두었다.
로부터 유도된 SH-SY5Y 신경모세포종의 세포독성에 대한 보호능을 측정하였다. 금불 초지상 부위의 70% 메탄올 추출물에 대하여 용매별로 분획을 실시하였고 핵산(Fr.H), 에틸아세테이트(Fr.EA) 및 물(Fr.W) 분획에 대하여 활성을 조사하였다. 분획 중 Fr.
금불 초 추출물의 항산화 효과는 DPPH radical, ABTS radical에 대한 소거능과 nitric oxide 소거능을 근거로 평가하였다. Fr.
이 반응에 50% Folin-Ciocalteu’s phenol 시 약 20 µL를 첨가하여 상온에서 30분간 방치한 후 microplate reader(Spectra Max 250, Molecular device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도를 달리한 (+)-catechin으로 표준검량곡선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.
SH-SY5Y 신경모세포종은 DMEM medium에 10% FBS와 50U/mL의 penicillin/streptomycin이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2가 유지되는 incubator에서 배양하였다. 세포에 대한 각 추출분획 및 H2O2의 독성, 각 분획의 H2O2로부터의 세포손상보호능은 MTT를 이용하여 측정하였다. 세포를 96 well plate에 접종한 후 70-80% confluency가 되었을 때, 각 농도별로 금불 초 추출분획을 2시간 처리한 후 이를 걷어내고 500 µM H2O2가 함유된 배양액으로 교체하여 2시간 더 처리하였다.
에 의한 직접적인 산화적 스트레스를 유발하고, 특히 산화적 손상에 민감한 인간 뉴런 기원의 신경모세포 모델을 사용하였다. 이를 위하여 금불 초지상 부위를 70% MeOH로 침출시킨 후 hexane, petroleum ether, chloroform, ethyl acetate를 이용하여 분획하고 hexane, ethyl acetate, water 분획물의 항산화 특성과 H2O2 에 의해 유도된 SH-SY5Y 세포의 사멸에 대한 보호 효과를 측정하였다.
H)을 얻었다. 이어서 같은 방법으로 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate의 차례로 분획을 실시하여 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate(Fr.EA) 분획을 얻은 후 감압 농축하여 건조시켰고 마지막에 남은 물분획층(Fr.W)은 동결건조기(Labconco Co., Kansas city, MO, USA)를 이용하여 건조시켰다. 미량의 시료가 얻어진 petroleum ether 및 chloroform 분획을 제외한 각 3 분획은 100 mg/mL 농도로 dimethyl sulfoxide에 녹여 등분한 후, −80℃ 초저온 냉동고(DF8520, Ilshin lab.
세포를 96 well plate에 접종한 후 70-80% confluency가 되었을 때, 각 농도별로 금불 초 추출분획을 2시간 처리한 후 이를 걷어내고 500 µM H2O2가 함유된 배양액으로 교체하여 2시간 더 처리하였다. 이어서 성장배지로 교체하여 18시간 배양한 후 0.5 mg/mL의 MTT를 약 2시간 처리하여 생성된 MTT formazan을 dimethyl sulfoxide에 용해시켜 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 추출분획 및 H2O2의 단독 처리에 의한 독성은 위의 순서에 따르되 추출분획 또는 H2O2만을 농도별로 2시간 처리하여 분석하였다.
대상 데이터
금불 초는 강원도 동해의 한약상에서 구입하였다. 시료의 수확 시기는 9-10월경이며 뿌리와 꽃이 제거된 건 조상태의 지상 부위를 2007년 2월에 구입하였다.
세포 내 ROS 측정은 2',7'-dichlorofluoroescein diacetate(DCFH�DA)가 세포 내로 투과된 후 아세틸기가 유리된 2',7'-dichloroflu�oroescin(DCFH)의 형태에서 ROS와 반응하여 형광물질을 생성하는 성질을 이용하였다.
금불 초는 강원도 동해의 한약상에서 구입하였다. 시료의 수확 시기는 9-10월경이며 뿌리와 꽃이 제거된 건 조상태의 지상 부위를 2007년 2월에 구입하였다. 총 폴리페놀/플라보노이드 함량 측정과 항산화 실험에 사용된 Folin-Ciocalteu’s phenol 시약은 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였고, AlCl3은 Junsei(Tokyo, Japan)에서, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltertrazolium bromide(MTT)는 Amresco Inc.
(Solon, OH, USA)에서 구입하였다. 신경모세포주 SH-SY5Y는 한국세포주은행(Korea cell line bank, Seoul, Korea)으로부터 분양받았고 세포배양에 사용된 배지 및 항생물질은 Hyclone(Logan, UT, USA)에서, fetal bovine serum은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 이외에 사용된 시약은 Sigma-Aldrich 제품 및 일반 특급시약을 사용하였다.
이론/모형
Cells were treated with each fraction or H2O2 as indicated in material and methods. Viable cells were analyzed using the MTT assay. Fr.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(18)에 의하여 측정하였다. 각 추출물 시료 80 µL에 2% Na2CO3 100 µL를 가한 후 상온에서 5분간 반응시켰다.
성능/효과
W는 동일 조건하의 대조구에 비교하였을 때 62.5 µg/mL 농도에서 35.0%의 세포 사멸을 억제하여 유의적인 보호 효과를 나타내었으며, 125 µg/mL 및 250 µg/mL 농도에서는 각각 71.7%, 77.0%의 세포 사멸을 억제하였다(Fig. 6C).
다른 분획들에 비하여 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량, 항산화능이 가장 높고 독성이 낮았던 Fr.W이H2O2에 의해 유도된 SH-SY5Y 신경모세포종의 독성에 대한 현저한 보호효과를 나타내었다. Fr.
4). 이상의 결과는 각 분획물의 총 폴리페놀, 플라보노이드 물질의 함량과 일관된 경향을 나타내는 것으로서 금불 초의 폴리페놀류 및 플라보노이드류 등이 이러한 radical 소거능의 주요 역할을 하는 것으로 보인다
8%의 세포 내 ROS를 감소시켰다. 이상의 결과는 금불 초분획물의 폴리페놀 함량 및 항산화 활성이 H2O2에 의해 유도된 신경모세포종의 세포사멸보호능 및 세포 내 ROS 소거능과 상관관계를 갖고 있으며, 이러한 활성이 ROS에의해 야기되는 뇌세포 사멸에 대한 보호작용에 공헌할 수 있음을 시사한다. 한편 보다 구체적인 활성성분의 화학적 특성 및 극성물질로서의 생체이용율에 대한 한계점들을 극복하기 위한 연구가 지속적으로 진행되어야 할 것으로 사료된다.
후속연구
이러한 금불 초Fr.W의 항산화 활성은 ROS에 의해 야기되는 뇌세포 독성에 대한 보호작용에 공헌할 수 있을 것으로 예상된다.
이상의 결과는 금불 초분획물의 폴리페놀 함량 및 항산화 활성이 H2O2에 의해 유도된 신경모세포종의 세포사멸보호능 및 세포 내 ROS 소거능과 상관관계를 갖고 있으며, 이러한 활성이 ROS에의해 야기되는 뇌세포 사멸에 대한 보호작용에 공헌할 수 있음을 시사한다. 한편 보다 구체적인 활성성분의 화학적 특성 및 극성물질로서의 생체이용율에 대한 한계점들을 극복하기 위한 연구가 지속적으로 진행되어야 할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
금불초에 관한 연구로는 무엇이 있는가?
금불초에 관한 연구로는 추출 essential oil에 대한 성분 분석(4), chloroform 추출물에서 분리한 taraxasteryl acetate의 간보호 효과(5), 선복화로부터 분리된 sesquiterpene lactone류의 암세포 사멸유도 효과(6,7), nitric oxide synthase와 cyclooxygenase-2의 억제능(8,9), glutamate에 의해 유도된 뇌세포 괴사에 대한 보호능(10),자가면역성 당뇨에 대한 보호능(11) 등이 있다. 금불초 활성성분으로 O,O-diacetylbritannilactone, O-acetylbritannilactone 등의 ses-quiterpene류가 밝혀졌으며(7) 그 외에 n-BuOH 추출물에서 분리된 patuletin, nepetin, axillarin 등의 flavonoids에 대한 활성도 보고 되어 있다(10).
금불초는 무엇인가?
금불초(Inula britannica var. chinensis Regel)는 국화과(Compositae)에 속하는 여러해살이풀로 우리나라 전역과 일본, 중국, 내몽고, 소련에 분포한다. 습기를 잘 견디고 건조한 곳에서 잘 자라 재배하기 쉽다.
금불초의 특징은 무엇인가?
chinensis Regel)는 국화과(Compositae)에 속하는 여러해살이풀로 우리나라 전역과 일본, 중국, 내몽고, 소련에 분포한다. 습기를 잘 견디고 건조한 곳에서 잘 자라 재배하기 쉽다. 땅속줄기가 발달하여 퍼지고 줄기는 곧게 자라며 잎은 끝이 뾰족한 타원형이다. 7-9월에 지름 3-4 cm의 노란색 꽃이 피는데 한방에서는 금불초의 꽃을 말린 것을 선복화라고 하여 약으로 쓰이며 이는 거담, 진해, 건위, 진토, 진정 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
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