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문제 정의
- 본 연구에서는 hydrogel의 이러한 특성을 이용하여 경피 흡수시스템을 이용한 제제를 개발하여 동물의 여러 가지 상처모델에 적용하고 그 효과를 평가하였다. 실험에 사용한 동물 모델은 thermal burn rat model과 excision wound rat model을 각각 작성하여 평가하였다.
제안 방법
- 13) Patch를 적용하지 않은 open wound 군을 대조군으로 하고 약물처치군은 hydrogel과 BAND-AIDR®를 2일에 한번 씩 각각 반복 적용하여 12일째 까지 상태를 관찰하였다.
- 8-12) Patch를 적용하지 않은 open wound 군을 대조군으로 하고 약물처치군은 hydrogel patch를, 비교 시험군 BAND-AIDR®를 2일에 한번씩 각각 반복 적용하여 12일째 까지 상태를 관찰하였다.
- Excision wound의 평가는 초기 상처의 크기에 대한 관찰 시 상처 크기의 백분율로 하여 평가하는데 그 값이 50%가 되는 healing time 50% (H50%)을 평가하였다. Figure 2에서 볼 수 있듯이 대조군의 H50%는 약 8.
- Sprague Dawley계 웅성 흰쥐(200~250 g)를 pentobarbital sodium(50 mg/kg)으로 복강 주사하여 마취시킨 후 electric clipper로 등피부의 털을 피부에 상처가 나지 않도록 주의하여 제거하였다. 털이 깨끗이 제거된 등피부에 직경 1 cm인 thermal controlled device를 이용하여 200℃에서 10초간 적용하여 thermal burn model을 작성하였다.
- Sprague Dawley계 웅성 흰쥐(200~250 g)를 pentobarbital sodium(50 mg/kg)으로 복강 주사하여 마취시킨 후 electric clipper로 등피부의 털을 피부에 상처가 나지 않도록 주의하여 제거하였다. 털이 깨끗이 제거된 등피부에 직경 1 cm인 thermal controlled device를 이용하여 200℃에서 10초간 적용하여 thermal burn model을 작성하였다.
- 13) Patch를 적용하지 않은 open wound 군을 대조군으로 하고 약물처치군은 hydrogel과 BAND-AIDR®를 2일에 한번 씩 각각 반복 적용하여 12일째 까지 상태를 관찰하였다. 각 군을 6마리씩 3군으로 하였으며 상처치료에 대한 평가는 초기 상처의 크기에 대한 관찰시 상처 크기의 백분율로 하여 평가하였다.
- 8-12) Patch를 적용하지 않은 open wound 군을 대조군으로 하고 약물처치군은 hydrogel patch를, 비교 시험군 BAND-AIDR®를 2일에 한번씩 각각 반복 적용하여 12일째 까지 상태를 관찰하였다. 각군을 6마리씩 3군으로 하였으며 상처 치료에 대한 평가는 상처의 상태를 보고 물집의 유무와 흉터의 크기, 색의 정도로 평가하였다.
- 사용세포주 및 배양방법 − 방사선 멸균처리방법을 사용하므로 이 과정 중 발생 할 수 있는 세포독성을 측정하기 위하여 hydrogel의 세포독성시험을 수행하였다.
- Positive cytotoxic control에는 배지에 용해한 SDS (200 µmole/L) 100 µL를 사용하였다. 세포독성 측정 및 판정은 흡광도를 측정한 후 다음의 식을 이용하여 세포독성을 계산하였다.
- 시료의 조제 − 시료의 조제는 hydrogel 또는 BAND-AIDR®을 각각 1 g 씩 칭량 한 후 멸균한 가위로 잘라서 50 mL 멸균튜브에 넣고 DMEM 배지(HEPES로 pH 7.0 조절) 10 mL를 가하여 37℃에서 18시간 추출 배양한 후 배지로 10x, 100x, 1000x로 희석하여 0.2 µm syringe filter로여과한 후 시험에 사용하였다.
- Table I의 처방을 이용하여 hydrogel을 제조하였다. 제조 방법을 간단히 설명하면 먼저 aluminium hydroxide와 sodium polyacrylate, glycerin 및 EDTA를 혼합한 다음 tartaric acid 와 tween80 및 water를 혼합한 용액과 교반 혼화하여 hydrogel을 만든 후 patch를 제조하였다. 제품의 멸균처리를 위하여 감마선 25 kGy를 적용한 후 완제품으로 한 것을 (주) 티디에스팜(서울, 한국)에서 제공받아 시험에 사용하였다.
- 즉, 96 well plate에 배양한 fibroblast 104 cells을 각 well에 넣고 4일간 배양한 후 배양액을 버리고 각 well에 추출한 시료 100 µL, 대조군은 배양액 100 µL를 처리하였다.
- Sprague Dawley계 웅성 흰쥐(200~250 g)를 pentobarbital sodium (50 mg/kg)으로 복강 주사하여 마취시킨 후 electric clipper로 등피부의 털을 피부에 상처가 나지 않도록 주의하여 제거하였다. 털이 깨끗이 제거된 등피부에 직경 0.8 cm인 skin punch를 이용하여 등 피부를 절개하여 excision wound rat model을 작성하였다.13) Patch를 적용하지 않은 open wound 군을 대조군으로 하고 약물처치군은 hydrogel과 BAND-AIDR®를 2일에 한번 씩 각각 반복 적용하여 12일째 까지 상태를 관찰하였다.
- Sprague Dawley계 웅성 흰쥐(200~250 g)를 pentobarbital sodium(50 mg/kg)으로 복강 주사하여 마취시킨 후 electric clipper로 등피부의 털을 피부에 상처가 나지 않도록 주의하여 제거하였다. 털이 깨끗이 제거된 등피부에 직경 1 cm인 thermal controlled device를 이용하여 200℃에서 10초간 적용하여 thermal burn model을 작성하였다.8-12) Patch를 적용하지 않은 open wound 군을 대조군으로 하고 약물처치군은 hydrogel patch를, 비교 시험군 BAND-AIDR®를 2일에 한번씩 각각 반복 적용하여 12일째 까지 상태를 관찰하였다.
대상 데이터
- Hydrogel patch는 (주)티디에스팜(서울, 한국)에서 제공받아 사용하였다. 비교 시험 군으로 사용한 BAND-AIDR® (Johnson & Johnson)는 시중에서 구입하여 사용하였다.
- Sprague Dawley계 흰쥐(200~250 g, male)를 일정한 조건(온도: 22±1℃, 습도: 50±5%, 명암: 12시간 bright/dark cycle)에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 비교 시험 군으로 사용한 BAND-AIDR® (Johnson & Johnson)는 시중에서 구입하여 사용하였다. Thermal controlled device (Jfli사, Temperature controlled soldering station, JF96, Taiwan)를 사용하였다. 세포독성시험에 사용한 배지 fetal bovine serum (FBS) 및 Dulbecco’s modified eaglemedium (DMEM)은 Gibco BRL(NY, USA)을, 그리고 Sodium dodecyl sulfate (SDS) 및 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)는 Sigma Chem.
- MTT reduction test는 세포의 생존율을 측정하는 방법으로 많이 이용되고 있다. 본 시험에 사용한 hydrogel은 점성이 큰 시료이므로 각 시료를 배지로 적당하게 희석 즉, 10배, 100배 및 1000배로 희석하여 시험에 사용하였다. Positive cytotoxicity control group (SDS함유)은 87.
- 비교 시험 군으로 사용한 BAND-AIDR® (Johnson & Johnson)는 시중에서 구입하여 사용하였다.
- 사용세포주 및 배양방법 − 방사선 멸균처리방법을 사용하므로 이 과정 중 발생 할 수 있는 세포독성을 측정하기 위하여 hydrogel의 세포독성시험을 수행하였다. 사용세포주는 Fibroblast (CCD-986SK, skin, human)은 한국세포주은행에서 분양받아, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 plastic culture dish에서 3일마다 배지를 교환하며, 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다.
- 제조 방법을 간단히 설명하면 먼저 aluminium hydroxide와 sodium polyacrylate, glycerin 및 EDTA를 혼합한 다음 tartaric acid 와 tween80 및 water를 혼합한 용액과 교반 혼화하여 hydrogel을 만든 후 patch를 제조하였다. 제품의 멸균처리를 위하여 감마선 25 kGy를 적용한 후 완제품으로 한 것을 (주) 티디에스팜(서울, 한국)에서 제공받아 시험에 사용하였다.4)
데이터처리
- 모든 데이터는 평균 값±표준편차(S.D.)로 나타내었으며 통계분석은 SPSS/WIN 15.0 프로그램을 사용하였다.
- 약효평가 파라미터의 유의성 검정은 one-way analysis of variance(ANOVA), Duncan multiple ranges test를 적용하여 대조군과 약물처치군을 비교하여 p<0.05일 때 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
- 시험방법 − 시험방법은 류 등의5-7) 방법에 따라 시험하였다.
- 본 연구에서는 hydrogel의 이러한 특성을 이용하여 경피 흡수시스템을 이용한 제제를 개발하여 동물의 여러 가지 상처모델에 적용하고 그 효과를 평가하였다. 실험에 사용한 동물 모델은 thermal burn rat model과 excision wound rat model을 각각 작성하여 평가하였다.
성능/효과
- 1) Hydrogel patch를 thermal burn rat model에 적용한 군이 대조군에 비해 화상상처의 특징발현을 빠르게 나타나게 하고 결과적으로 치료 효과도 빠름을 볼 수 있었다.
- 2) Excision wound rat model에서 hydrogel patch를 적용한 군의 H50%는 6.0일, BAND-AID®를 적용한 군의 H50%는 5.7일, 그리고 대조군의 H50%는 8.3일을 나타내었다.
- 후자의 경우 대부분 온도나 pH 등의 변화에 의하여 수용액에서 hydrogel로 가역적으로 변하는 특성을 갖는다.2,3) Hydrogel은 생체적합성이 높은 물질로 다량의 물을 흡수한 상태에서는 생체의 조직과 유사한 거동을 보인다. 그러므로 의학, 제약 및 그들의 높은 함수율 특성과 관련된 분야에서 많이 연구되고 쓰이고 있다.
- 그러나 대조군은 그 이후로 상처가 회복되지 않고 반원모양의 흉터가 생겼다. Hydrogel patch를 적용군의 상처는 4일째 2도 화상 상처가 나타났으며, 그 이후로 상처의 크기가 지속적으로 빠르게 줄어드는 것을 알 수 있었다. 비교시험군인 BAND-AID® 적용군의 상처는 대조군의 상처에 비해 화상상처의 특징이 잘 나타나지 않고 물집이 생기는 2도 화상이 8일째 나타나게 되고 그 이후 서서히 회복되었다.
- 비교시험군인 BAND-AID® 적용군의 상처는 대조군의 상처에 비해 화상상처의 특징이 잘 나타나지 않고 물집이 생기는 2도 화상이 8일째 나타나게 되고 그 이후 서서히 회복되었다. Hydrogel 군과 BAND-AIDR 군은 대조군에 비해 화상상처의 특징발현을 빠르게 나타나게 하고 결과적으로 치료 효과도 빠르게 진행됨을 알 수 있었으며 두 군 간에는 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다.
- Hydrogel 군과 비교시험군인 BAND-AID® 군 간의 유의성 있는 차이를 나타내지 않았으며, 두군 모두 대조군에 비하여 매우 빠른 치료효과를 나타내었다.
- Positive cytotoxicity control group (SDS함유)은 87.4% 의 세포독성을 나타내었으며, 그 외 본 실험에 사용한 시료 2종, hydrogel patch 및 BAND-AID®의 희석시료들은 모두 (−) 값을 나타내어 세포독성이 없는 것으로 사료되었다.
- 여러 가지 상처모델에 hydrogel patch를 적용하여 상처치료효과를 검토한 결과 hydrogel이 화상 및 창상 치료에 효과적임을 알 수 있었다.
- 4% 의 세포독성을 나타내었으며, 그 외 본 실험에 사용한 시료 2종, hydrogel patch 및 BAND-AID®의 희석시료들은 모두 (−) 값을 나타내어 세포독성이 없는 것으로 사료되었다. 이상의 결과로 본 실험에 사용한 방사선으로 멸균처리 된 제품을 human fibroblast cell을 이용하여 한 실험결과 세포독성이 없는 것으로 평가할 수 있었다.
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