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문제 정의
- 하지만 최근 백신의 제조 및 보관 기술의 발달 등에 의하여 백신의 안정성을 높임으로써 유효기간 연장할 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 2005년부터 2008년까지 매년 생산되어 비축용으로 보관되고 있는 우역 생백신의소에 대한 역가시험과 백신 내 바이러스 함량시험을 통하여 백신의 유효기간을 재평가하고자 하였다.
제안 방법
- 1954년에는 가축위생연구소의 이와 김이 [7] 발육란(chicken embryo)에 대한우역병독의 감염시험을 수행하였으며, 1960년 초반에 문등 [5, 6]이 면역효과가 우수한 변이생독백신을 생산할목적으로 가토화 . 계태화 우역바이러스를 도입하여 시험백신을 생산하여 한우에 대한 병원성과 면역원성을 조사한 이후 백신 생산 기초시험으로 동결건조 바이러스의 보존성 및 소에 대한 면역효과와 면역지속성 등을 조사하였다. 그 후 권 등 [3]이 Vero, BGK, CEF 세포에서의 조직배양법을 이용한 백신 생산으로 개량 응용되었다.
- 또한, 유효기간이 초과된 우역 백신의 효능 재평가를위하여 4년 동안 생산된 제품중에서 가장 오래된 2005년 제품을 선발하여 송아지 2두에 접종하여 접종전, 접종 후 21일, 75일과 90일째에 혈액을 채혈하여 중화항체가를 조사하였다.
- 2마리를 실험에 사용하였다. 마우스에는 검사품(10 두분)의 현탁액 0.5 mL를 북강에, 기니픽에는 2.0 mL을복강 내 접종하고 14일간 관찰하였다. 송아지에는 10두분LmL를 목의 피하에 접종하고 14일간 관찰하여 접종부위에 이상반응, 몸무게 변화, 체온 상승 등의 임상증상을 관찰하였다.
- 1 mL씩 각각 접종하고 37°C에서 7일간 회전배양하면서 CPE 출현여부를 관찰하였을 때 바이 러스 함량이 lO5OTCID5o/mL 이상인 경우에 백신 생산에 사용하였다. 바이러스 함량을 조정한 원액의 80%와 보호제 20%(lactose 800 g, KH, PO4 4.53 g, K2HPO4 10.03 g, KH4PO4-L-glutamate 80 g, gelatin 80 g, 증류수 4, 000 mL, antibiotics 30mL)를 잘 혼합하고 일정량을 멸균된 소분용기에 분주하여 동결 건조하였다. 동결 건조 후 바이 러스 함량이 IO30 TCIDjo/mL (50% Tissue culture infective dose)이상일 때 적합한 백신으로 판정하였다.
- 백신의 유효기간 설정을 위하여 2005년부터 2008년까지 매년 생산된 4개 롯트의 냉장상태에서 보관되고있는 제품 3병을 무작위로 선발하여 경시별로 바이러스함량을 국가검정 동물용의 약품 검정기준 방법에 준하여 조사하였다 [2]. 이를 위해 Vero cell을 2배 volume의 배지를 넣어 부유시킨 후 cell culture 15 mL tube 당 1 mL 씩 넣은 cell이 부착할 때까지 정치 배양하고 우역백신 vial 1개를 10mL 멸균 증류수에 부유시킨 후 1 mL(l 두분)을 배지에 10배수 계 단 희석(KT% IO-% 1( per 1 mL)하여 tube 당 해당 희석배수 IOOjiL을 넣고 37°C 에서 7일간 회전배양하면서 CPE 형성 유무를 관찰하여바이 러스 함량을 TCIEy 값으로 결정 하였다.
- 계태화 우역바이러스를 Vero cell에 계대 배양한 것으로서 103,CIDWmL 이상의 역가로 건강한 송아지 근육 내에 접종하였을 때 경미한 발열 이외에 특별한 부작용이 없이 높은 면역원성을 나타내는 것으로 알려져 있다 [3, 8]. 본 연구에서는 2005년부터 2008년까지 생산되어 보관되고 있는 4개 롯트의 우역 생백신의 보관품에 대한 경시별 바이러스 함량을 조사하여 백신의 안정성을 재평가한 바, 백신 제조 후 3, 10, 15, 22, 27, 34, 39, 45개월이 되는 보관품 모두에서 우역 생백신 국가검정기준 [2]에서 제시한 합격기준인 IO30 TCIDjo/mL 이상으로 조사되었다. 즉, 백신의 권장 유효기간인 12개월보다도 휠씬 초과된 45개월째에도 백신 내 바이러스 함량이 안정적으로 유지되고 있음을 알 수 있었다.
- 시험 백신주의계 대 및 보존을 위 하여 African green monkey kidney 유래의 Vero 세포(/VTCC CCL81)를 사용하였다. 세포 증식용 배지로는 5% calf serum고卜 항생제가 첨가된 alpha- MEM(Gibco, USA) 를 사용하였다.
- 0 mL을복강 내 접종하고 14일간 관찰하였다. 송아지에는 10두분LmL를 목의 피하에 접종하고 14일간 관찰하여 접종부위에 이상반응, 몸무게 변화, 체온 상승 등의 임상증상을 관찰하였다.
- 수확된 바이러스를 10배 단계 희석하여 각 희석단위별로 Vero 세포배양 시험관 5개에 0.1 mL씩 각각 접종하고 37°C에서 7일간 회전배양하면서 CPE 출현여부를 관찰하였을 때 바이 러스 함량이 lO5OTCID5o/mL 이상인 경우에 백신 생산에 사용하였다. 바이러스 함량을 조정한 원액의 80%와 보호제 20%(lactose 800 g, KH, PO4 4.
- [2]. 이를 위해 Vero cell을 2배 volume의 배지를 넣어 부유시킨 후 cell culture 15 mL tube 당 1 mL 씩 넣은 cell이 부착할 때까지 정치 배양하고 우역백신 vial 1개를 10mL 멸균 증류수에 부유시킨 후 1 mL(l 두분)을 배지에 10배수 계 단 희석(KT% IO-% 1( per 1 mL)하여 tube 당 해당 희석배수 IOOjiL을 넣고 37°C 에서 7일간 회전배양하면서 CPE 형성 유무를 관찰하여바이 러스 함량을 TCIEy 값으로 결정 하였다.
- 제조된 백신의 품질관리차원에서 동물용의약품 생물학적 제제 일반시험법 [2]에 준하여 특성시험, 진공도 시험, 함습도시험, 무균시험, 미입바이러스 부정시험을 실시하여 합격된 것을 최종제품으로서 정하고, 4°C + 2°C 냉장시설에서 비축용 백신으로 장기간 보존하면서 무작위로 선발하여 백신의 안정성 및 유효성 시험을 실시하였다.
- 한편, 본 연구에서 유효기간 만료 후에도 바이러스 함량이 유지되고 있는 것으로 확인된 보관품 중에서 보관기간이 가장 오래된 2005년도에 제조하여 3년 3개월 동안 보관되고 있는 백신을 송아지 2두에 백신 접종 후 21 일, 75일, 90일째에 바이러스 중화항체가를 재평가하였다. 그 결과 모든 송아지에서 2005년부터 2008년까지 4 회에 걸쳐서 조사한 면역원성 결과와 유사한 16배의 중화항체가를 나타내었다.
대상 데이터
- 우역 생백신 제조에는 가토화 . 계태화 우역바이러스를 원숭이 신장세 포에 f农ro cell)에 계대 배양한 lapinized- avianized tissue culture 주를 사용하였다. 시험 백신주의계 대 및 보존을 위 하여 African green monkey kidney 유래의 Vero 세포(/VTCC CCL81)를 사용하였다.
- 생산된 백신의 안전성을 확인하기 위하여 멸균 증류수에 백신을 부유시킨 후 체중 13〜 15 g의 건강한 마우스 10마리, 체중 300-350 g^] 건강한 기니픽 4마리, 그리고 체중 10A150kg의 우역바이러스 항체 음성인 송아지 2마리를 실험에 사용하였다. 마우스에는 검사품(10 두분)의 현탁액 0.
- 계태화 우역바이러스를 원숭이 신장세 포에 f农ro cell)에 계대 배양한 lapinized- avianized tissue culture 주를 사용하였다. 시험 백신주의계 대 및 보존을 위 하여 African green monkey kidney 유래의 Vero 세포(/VTCC CCL81)를 사용하였다. 세포 증식용 배지로는 5% calf serum고卜 항생제가 첨가된 alpha- MEM(Gibco, USA) 를 사용하였다.
- 우역 생백신은 국립수의과학검역원의 동물용의 약품생물학적제제 기준에 의하여 의 제조하였다 [1]. 즉, Vero 세포를 세포증식용 배지에 부유시켜 37。(:에서 2〜3일간배양하고 배양세포의 단층이 형성되었을 때 우역 백신제조용 바이러스(seed virus)로부터 5대 이내 계대한 우역 바이 러 스 역 가가 0.
이론/모형
- 백신의 효능시험은 안전시험이 끝난 송아지 2마리를 7일 후에 채혈한 혈청에 대하여 우역 생백신 국가검정기준의 혈청 역가시험법에 준하여 중화항체가를 조사하였다 [2]. 가검혈청을 56°C 30분간 비동화한 후 증식용배양액으로 2진법으로 희석하여 각 희석혈청 0.
성능/효과
- 2005년부터 2008년까지 매년 생산되어 비축용으로 보관되고 있는 4개 롯트의 우역 생백신에 대하여 최초 생산품에서부터 냉장 보관 후 3, 10, 15, 22, 27, 34, 39, 45 개월이 되는 현 시점까지 백신 내 바이러스 함량을 조사한 바, 모든 제품에서 합격 검정기준인 iowtcid” mL 이상을 나타내었다. 또한, 2005년도에 제조하여 3년 3개월 동안 보관되고 있는 백신을 송아지 2두에 접종하여 바이러스 중화항체가를 조사한 바, 유효기간 내의 백신 효능과 유사한 성적을 나타내었다.
- 각 롯트별 보관 백신에 포함되어 있는 백신바이러스 역가를 측정한 결과, 2005년부터 2008년까지 생산된 4개 우역 생백신의 최초 생산품에서부터 냉장 보관 후 3, 10, 15, 22, 27, 34, 39, 45개월이되는 현재까지 모두에서 IO, .叮CIDWmL 이상으로 상당기간 유효기간이 지났음에도 합격 검정기준에 적합하였으며, 유효기간 내에 있는 2008년 생산한 제품과도 통계학적으로 차이가 없는 것으로 나타났다(Table 4).
- 있음이 확인되었다. 각 롯트별 보관 백신에 포함되어 있는 백신바이러스 역가를 측정한 결과, 2005년부터 2008년까지 생산된 4개 우역 생백신의 최초 생산품에서부터 냉장 보관 후 3, 10, 15, 22, 27, 34, 39, 45개월이되는 현재까지 모두에서 IO, .叮CIDWmL 이상으로 상당기간 유효기간이 지났음에도 합격 검정기준에 적합하였으며, 유효기간 내에 있는 2008년 생산한 제품과도 통계학적으로 차이가 없는 것으로 나타났다(Table 4).
- 그 결과 모든 송아지에서 2005년부터 2008년까지 4 회에 걸쳐서 조사한 면역원성 결과와 유사한 16배의 중화항체가를 나타내었다. 이러한 결과는 이 백신의 역가시험의 국가검정 권장 기준인 10배에 도달되어 [2] 백신유효기간이 2년 3개월이 경과한 시험백신에 있어서도 면역 항체를 형성하는데 있어서도 문제가 없음이 확인되었다.
- 03 g, KH4PO4-L-glutamate 80 g, gelatin 80 g, 증류수 4, 000 mL, antibiotics 30mL)를 잘 혼합하고 일정량을 멸균된 소분용기에 분주하여 동결 건조하였다. 동결 건조 후 바이 러스 함량이 IO30 TCIDjo/mL (50% Tissue culture infective dose)이상일 때 적합한 백신으로 판정하였다.
- 또한, 본 연구에서 백신제조 단계별 바이러스 함량 변화를 조사해 보았을 때 보호제 혼합 비율과 동결건조과정에서 평균적으로 lOMTCIDWmL의 바이러스 함량이 감소되었지만 동결 건조 후에서 냉장 보관단계에서는 바이러스 함량에 있어서 거의 변화가 없는 것으로 나타났다. 따라서 우역 백신 내 적정 바이러스 함량에 도달하고 유효기간을 연장하기 위해서는 무엇보다도 백신제조 시 동결건조 전에 바이러스 함량이 lO5OTCID5o/mL 이상 되도록 높게 생산하는 것이 가장 중요할 것으로 사료된다 [1].
- 백신의 유효기간 재설정을 위하여 2005년부터 생산된 제품에 대하여 동물용 생물학적 제제 특성시험법 준하여 일반적인 성상을 조사한 바, 백신의 색깔 변화 또는 특이한 침전물의 생성이 육안적으로 관찰되지 않아 보존 기간 동안 백신의 물리화학적 성상은 균일하게 유지되고 있음이 확인되었다. 각 롯트별 보관 백신에 포함되어 있는 백신바이러스 역가를 측정한 결과, 2005년부터 2008년까지 생산된 4개 우역 생백신의 최초 생산품에서부터 냉장 보관 후 3, 10, 15, 22, 27, 34, 39, 45개월이되는 현재까지 모두에서 IO, .
- 본 연구에서의 냉장 보관중인 시험백신의 바이러스함량과 송아지에서의 면역원성 시험에 의한 안정성 성적을 종합해 볼 때 우역 생백신의 유효기간을 현재의 12 개월에서 36개월로 연장할 수 있을 것으로 사료된다. 이와 같이 우역 백신의 유효기간 연장을 통하여 매년 우역 백신의 생산 및 검정을 위하여 사용되는 예산과 노동력을 절감할 수 있을 것으로 기대된다.
- 1). 생산된 우역 백신의 송아지에 대한 면역원성시험에서 모두 16배 이상의 혈중 중화항체가를 나타내어 역가시험의 권장 기준인 10배에 도달되었음을 확인하였다(Table 2).
- 또한, 2005년도에 제조하여 3년 3개월 동안 보관되고 있는 백신을 송아지 2두에 접종하여 바이러스 중화항체가를 조사한 바, 유효기간 내의 백신 효능과 유사한 성적을 나타내었다. 이러한 사실에 비추어 볼 때 우역 생백신의 유효기간을 현재의 12개월에서 36개월로 연장할 수 있을 것으로 생각한다.
- 16배의 중화항체가를 나타내었다. 접종한 백신의 항체 지속성을 조사하기 위히여 접종 후 75일과 90일째에 항체가를 조사한 바, 16배-32배를 나타내어 최소한 백신접종 후 3개월까지는 면역항체가 안정적으로 유지되고 있었다.
- 본 연구에서는 2005년부터 2008년까지 생산되어 보관되고 있는 4개 롯트의 우역 생백신의 보관품에 대한 경시별 바이러스 함량을 조사하여 백신의 안정성을 재평가한 바, 백신 제조 후 3, 10, 15, 22, 27, 34, 39, 45개월이 되는 보관품 모두에서 우역 생백신 국가검정기준 [2]에서 제시한 합격기준인 IO30 TCIDjo/mL 이상으로 조사되었다. 즉, 백신의 권장 유효기간인 12개월보다도 휠씬 초과된 45개월째에도 백신 내 바이러스 함량이 안정적으로 유지되고 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 이와 같이 우역 백신의 유효기간 연장을 통하여 매년 우역 백신의 생산 및 검정을 위하여 사용되는 예산과 노동력을 절감할 수 있을 것으로 기대된다.
- 이러한 결과는 이 백신의 역가시험의 국가검정 권장 기준인 10배에 도달되어 [2] 백신유효기간이 2년 3개월이 경과한 시험백신에 있어서도 면역 항체를 형성하는데 있어서도 문제가 없음이 확인되었다. 향후에도 계속해서 우역 생백신의 안정성이 어느 정도까지 지속될 수 있을 것인지에 대한 정기적인 평가가 있어야 할 것으로 사료된다.
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