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문제 정의
- -8, TNF 등의 분비를 억제하고 항염증효과를 보이며 호중구의 침윤을 억제한다는 사실과, 단핵구 및 호중구의 혈관내피세포로의 유착과 이동을 억제하여 조직에서의 염증반응을 감소시키고 호중구의 산화성 스트레스를 감소시키는 것이 밝혀졌다 [10, 11]. 본 연구에서는 이러한 사실들을 근거로 하여 moxifloxacin 이 내독소에 의해 유도된 급성폐손상에 어떠한 영향을 미치는지를 호중구성 산화성 스트레스 및 이에 따른 염증성 조절자인 cPLA2, sPLA2의 작용과 연관하여 알아보려 하였다.
제안 방법
- (2) 폐질량/체중비의 산정 (Lung weight/Body weight, L/BX103, L/B ratio): 내독소 투여 5시간 후에 흰쥐를 마취하여 체중을 측정하고 폐장을 적출하였다. 적출된 좌, 우 폐장의 무게를 측정한 뒤 폐질량/체중비를 계산하였다.
- (3) 폐세척액 (bronchoal.,eolar lavage fluid, BALF) 내의 단백 함량의 측정: 내독소에 의한 폐장 내 모세혈관의 손상에 따른 al.,eolar flooding을 확인하고 이때의 moxiflo- xacin 의 효과를 확인하기 위하여 폐세척액 내의 단백 함량을 정량하였다. 흰쥐를 마취한 뒤 치사시키고 기관절개를 시행하여 polyethylene tube를 삽관하였다.
- (4) 폐세척액에서 호중구수 산정: 혈관 및 간질 조직의 호중구가 폐포 내로 이동한 것을 확인하기 위하여 폐 세척액 내의 호중구 수를 산정하였다. 폐세척액의 상등액을 단백 정략에 이용하고 침전층을 다시 0.
- (5) 폐장 내 myeloperoxidase (MPO) 활성도의 측정: 폐장 내 호중구 침윤의 정도를 확인하기 위하여 MPO 의 활성도 (U/g of wet lung) 를 측정하였다. 흰쥐를 마취한 뒤 기관지를 절개하여 삽관 후 Harvard Rodent Ventilator 에 연결하고 개흉술을 시행하였다.
- (6) 폐장 내 malondialdehyde (MDA)의 측정: 산 화성 스트레스가 유발된 것을 확인하기 위하여 과산화지질 (lipid peroxide) 의 일종인 MDA 를 정량하였다. 흰쥐의 좌측폐장에 4.
- (9) 광학현미경을 이용한 폐장조직의 형태학적 관찰: 폐장의 손상과 moxifloxacin 의 효과를 보기 위해 흰쥐를 흡입마취 시킨 후 치사시키고 hematoxylin-eosin으로 염색한 폐장조직을 관찰하였다.
- 그 후 PBS로 10분씩 3회 세척한 후 2차 항체인 rabbit anti-goat IgG, FITC (Santa Cruz, USA)를 1 : 100 으로희석하여 실온에서 2시간 적용한 후 PBS 로 3회 세척하였다. Propidium iodide (0.01 mg/mL)로 10분간 대조 염색을 하고 fluorescent mounting medium (DAKO, USA) 으로 봉입한 후 관찰하였다.
- 1차 항체로는 goat anti-human sPLA2 polyclonal antibody (Santa Cruz, USA)를 1 : 200으로 희석하여 4oC에서 16시간 적용하였다. 그 후 PBS로 10분씩 3회 세척한 후 2차 항체인 rabbit anti-goat IgG, FITC (Santa Cruz, USA)를 1 : 100 으로희석하여 실온에서 2시간 적용한 후 PBS 로 3회 세척하였다. Propidium iodide (0.
- 흰쥐를 마취한 뒤 기관지를 절개하여 삽관 후 Harvard Rodent Ventilator 에 연결하고 개흉술을 시행하였다. 그 후 우심실에 1,000 단위의 헤파린을 주입한 후 폐동맥에 삽관하고 좌심실에 개 출구를 낸 뒤 Masterflex 관류펌프를 이용, 생리적 식염수를 관류하여 폐장 내의 혈액을 제거하였다. 좌, 우측 폐장을 적출하여 즉시 액체질소에 담그고 동결시킨 후 -70oC 에서 보관하였다.
- 그 후 균질액을 60oC 항온수조에서 120분간 처리하여 단백분해효소를 불활성 시킨 후 12, 000 rpm 으로 2분간 다시 원심분리 하였다. 상등액 0.1 mL 와 0.0168 mg 의 O-dianisidine 이 함유된 500 〃 M의 과산화수소 용액 3.9 mL 와 반응시켜 파장 460 nm 에서 분광 비색기를 이용 enzyme-kinetics 를 시행하였다.
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1) 실험재료
실험동물은 Sprague-Dawley 종 흰쥐 수컷(체중 250~300 g)을 사용하였으며, 대조군을 C군, 내독소(lipopolysaccharide, LPS) 로 급성폐손상을 유발한 군을 L 군, 급성폐손상 유발 후 moxifloxacin 을 주입한 군을 L-M군으로 나누어 실험을 진행하였다. 특별히 언급하지 않은 모든 시약은 Sigma 제를 사용하였고, cPLA2, sPLA2의 항체 및 secondary anti-donkey antibody 는 Santa Cruz 사 (USA) 제품을 사용하였다.
- 1 mL 의 생리적 식염수에 재부유 한 뒤 백혈구의 수를 산정하였다. 재부 유액의 일부를 이용하여 도말표본을 제작하고 건조 후 Wright 염색을 시행하여 전체의 백혈구 중 호중구가 차지하는 비율을 구한 다음 호중구 수를 계산하였다.
- 체중을 측정하고 폐장을 적출하였다. 적출된 좌, 우 폐장의 무게를 측정한 뒤 폐질량/체중비를 계산하였다.
- 내의 호중구 수를 산정하였다. 폐세척액의 상등액을 단백 정략에 이용하고 침전층을 다시 0.1 mL 의 생리적 식염수에 재부유 한 뒤 백혈구의 수를 산정하였다. 재부 유액의 일부를 이용하여 도말표본을 제작하고 건조 후 Wright 염색을 시행하여 전체의 백혈구 중 호중구가 차지하는 비율을 구한 다음 호중구 수를 계산하였다.
- (U/g of wet lung) 를 측정하였다. 흰쥐를 마취한 뒤 기관지를 절개하여 삽관 후 Harvard Rodent Ventilator 에 연결하고 개흉술을 시행하였다. 그 후 우심실에 1,000 단위의 헤파린을 주입한 후 폐동맥에 삽관하고 좌심실에 개 출구를 낸 뒤 Masterflex 관류펌프를 이용, 생리적 식염수를 관류하여 폐장 내의 혈액을 제거하였다.
- ,eolar flooding을 확인하고 이때의 moxiflo- xacin 의 효과를 확인하기 위하여 폐세척액 내의 단백 함량을 정량하였다. 흰쥐를 마취한 뒤 치사시키고 기관절개를 시행하여 polyethylene tube를 삽관하였다. 8.
대상 데이터
- (1) 실험동물에서 급성폐손상의 유발과 Moxifloxacin 의 투여: E.coli 내독소(E.coli 0217 : B8)를 이용하였고, LPS 100〃g을 마취한 흰쥐의 기도 내로 직접 분무하였다. Moxifloxacin hydrochloride (10 ㎎/㎏) 는 내독소 투여 30분 뒤에 복강 내로 투여하였다.
- 특별히 언급하지 않은 모든 시약은 Sigma 제를 사용하였고, cPLA2, sPLA2의 항체 및 secondary anti-donkey antibody 는 Santa Cruz 사 (USA) 제품을 사용하였다. Moxifloxacin 은 독일 Bayer 사로부터 기증받아 사용하였다.
- 진행하였다. 특별히 언급하지 않은 모든 시약은 Sigma 제를 사용하였고, cPLA2, sPLA2의 항체 및 secondary anti-donkey antibody 는 Santa Cruz 사 (USA) 제품을 사용하였다. Moxifloxacin 은 독일 Bayer 사로부터 기증받아 사용하였다.
데이터처리
- (10) 통계처리: 모든 성적은 평균土표준오차로 나타내었다. 유의성 검정은 Student-Neumann-Keul test를 이용하였고 p<0.
- 유의성 검정은 Student-Neumann-Keul test를 이용하였고 p<0.05 를 유의하다고 인정하였다.
성능/효과
- 1.군에서는 C 군에 비하여 활성도가 월등히 증가하였고, L-M 군은 L 군에 비하여 현저히 감소하였다 (Table 2).
- 1.군은 C 군에 비해 폐질량/체중비가 유의하게 증가하였고 L-M 군에서는 L 군에 비해 의미있게 감소하였다 (Table 1).
- 1.군은 C 군에 비해 현저히 증가하였고, L-M 군은 L 군에 비해 현저히 감소하였다 (Table 1).
- 1.군은 급성호흡곤란증후군 때 보이는 염증소견들 즉 perivascular cuffing, 호중구의 폐포강 내 유주, 출혈(적혈구의 혈관 밖으로의 이동), 폐포강 내 유리질막 (hyaline membrane) 의 형성, 폐포막 부종 등의 소견이 현저하나 L-M 군은 C 군과 거의 차이가 없었다 (Fig. 3).
- 지금까지는 sPLA2 가 주로 세포막의 인지질을 분해하여 염증성 지질분자를 유리한다고 알려졌지만 [19] 급성호흡곤란증후군에서 sPLA2의 역할이 크지 않다는 사실은 sPLA2 외에도 다른 종류의 PLA 2가 염증성 반응에 관여함을 시사한다. 내독소에 의한 급성 폐 손상이 PLA2의 매개에 의한 것은 분명하며 sPLA2, cPLA2 모두 관여하는 것으로 생각되지만 본 연구결과에 따르면 moxifloxacine cPLA2의 발현을 억제하여 염증반응을 억제하는 것으로 생각된다. Levy[2이에 따르면 cPLA2는 세포막의 인지질을 분해하여 염증성 지질분자를 유리할 뿐 아니라 호중구막의 NADPH oxidase를 eicosanoid를 통한 활성화가 아닌 또 다른 경로를 통해 활성화시켜 산소기의 생성을 증가시킨다고 한다.
- 본 연구에서는 내독소에 의해 유발된 급성폐손상의 많은 염증성 소견들이 moxifloxacin 에 의해 감소되는 것을 볼 수 있었다. 특히, 내독소에 의해 발현이 증가한 cPLA2 가 moxifloxacin 에 의해 억제됨을 확인하는 흥미로운 결과를 얻었다.
- 수 있었다. 특히, 내독소에 의해 발현이 증가한 cPLA2 가 moxifloxacin 에 의해 억제됨을 확인하는 흥미로운 결과를 얻었다. Moxifloxacin의 이러한 cPLA2발현억제효과는아직 알려진 바가 없고, cPLA2는 분자량이 다양한 아형들로 구성되어 있으므로 향후 moxifloxacin 에 특이성이 있는 cPLA2 에 대한 연구가 진행되어 급성 호흡곤란증후군에서 염증반응의 기전을 이해하게 되고 새로운 치료법을 개발할 수 있게 되기를 기대한다.
- 폐장조직의 산화성 스트레스에 의한 지질과산화의 산물인 MDA 함량은 C 군에 비해 L 군에서 현저히 증가한 반면 L-M 군에서는 L 군에 비하여 상당한 감소를 보였다 (Table 3).
후속연구
- 특히, 내독소에 의해 발현이 증가한 cPLA2 가 moxifloxacin 에 의해 억제됨을 확인하는 흥미로운 결과를 얻었다. Moxifloxacin의 이러한 cPLA2발현억제효과는아직 알려진 바가 없고, cPLA2는 분자량이 다양한 아형들로 구성되어 있으므로 향후 moxifloxacin 에 특이성이 있는 cPLA2 에 대한 연구가 진행되어 급성 호흡곤란증후군에서 염증반응의 기전을 이해하게 되고 새로운 치료법을 개발할 수 있게 되기를 기대한다.
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