선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 배추는 재배 온도에 따라 수확량과 품질에 많은 영향을 받을 수 있다. 고온 스트레스 저항성 배추품종 육성을 위해 본 연구는 스트레스 저항성에 관련이 있다고 알려진 trehalose 유전자 관련 다형성 마커를 개발하였다. 아라비돕시스 trehalose 합성 유전자와 유사한 총 28개의 배추 EST를 NCBI database에서 찾고 고온에 상대적으로 약한 지부품종과 고온에 잘 견디는 품종인 권심을 대상으로 다형성을 조사하였다.
- 많은 연구진들이 작물 생산성을 증가시키고 작물의 재배가능 지역을 확장 시키고자 스트레스를 유발하는 환경인 저온 또는 고온에서의 작물의 저항성을 개선시킨 새로운 품종 개발에 노력하고 있다. 이러한 경향에 맞춰 본 연구는 육종에 적용이 가능한 스트레스 저항성에 관련 분자마커개발을 위해 배추에서 trehalose 유전자 군의 다형성 마커를 개발하였다. 이를 이용하여 장기적으로 고온 저항성 직접적으로 연관된 DNA마커를 개발하여 내서성 배추품종 육성에 기초연구자료로 활용될 수 있다고 생각된다.
제안 방법
- CTAB method를 이용하여 얻은 지부와 권심 DNA를 각각 디자인한 프라이머를 이용하여 PCR증폭을 하였다. PCR에 사용된 모든 시약은 솔젠트 회사의 e-taq kit를 사용하였다.
- PCR 증폭을 해 얻은 DNA를 쏠젠트(주)에 염기서열분석을 의뢰하였다. 얻어진 염기서열분석 결과는 staden package 프로그램(http://staden.
- SNP를 대상으로 다형성을 보이는 마커 개발을 위하여 지부와 권심의 염기서열 데이터를 비교 분석하여 두 염기서열 간에 SNP 차이가 있음을 발견하였고(Fig. 2) 우선적으로 TH2와 TH5의 SNPs를 대상으로 프라이머의 3‘ 말단 마지막 염기서열 위치에 SNP가 위치하도록 프라이머를 제작하였다.
- 하지만 TH2의 경우는 대상 DNA와 프라이머의 마지막 서열이 불일치함에도 불구하고 지부와 권심 모두에서 PCR 증폭이 일어나 다형성을 보이는데 실패하였고 TH5의 경우는 권심 DNA만 증폭되어 우성(dominant) 마커로 사용이 가능함을 확인하였다(Table 2). TH2의 경우는 제한효소를 이용하여 SNP를 보이는 마커로 개발하였다.
- 하지만 모든 SNP 위치에 특정 제한효소의 인식서열이 반드시 존재하는 것은 아니므로 위와 같은 방법으로 모든 종류의 SNP의 다형성 마커를 개발하기 어렵다. 따라서 dCAP method [9]를 이용해 TH2와 TH26에 있어서 새로이 제작되는 프라이머에 각각 인위적인 PstI과 HindIII 제한효소 인식 염기서열을 가진 프라이머를 제작하였다. 예를 들어 HindIII 제한효소의 인식 염기서열은 AAGCTT 인데 TH26의 SNP 포함 염기서열은 권심의 경우 AAGCGT이다.
- 염기서열 분석은 쏠젠트(주)에 의뢰를 하였으며 얻어진 염기서열을 이용하여 SNP와 in/del 분석은 staden pakage program을 이용하여 수행했다. 발견된 SNPs와 in/del을 대상으로 아가로스 gel 상에서 다형성을 보여줄 수 있도록 새로운 프라이머를 제작하였다. 프라이머 제작 방법은 다음과 같은 방법으로 시도하였다.
- 아가로스 gel 상에서 DNA 크기 차이를 확인할 수 없었던 나머지 trehalose 관련 유전자 증폭 DNA는 염기서열분석을 통해 SNP or insertion or deletion (in/del) 다형성 유무를 확인하였다. 염기서열 분석은 쏠젠트(주)에 의뢰를 하였으며 얻어진 염기서열을 이용하여 SNP와 in/del 분석은 staden pakage program을 이용하여 수행했다.
- 고온 스트레스 저항성 배추품종 육성을 위해 본 연구는 스트레스 저항성에 관련이 있다고 알려진 trehalose 유전자 관련 다형성 마커를 개발하였다. 아라비돕시스 trehalose 합성 유전자와 유사한 총 28개의 배추 EST를 NCBI database에서 찾고 고온에 상대적으로 약한 지부품종과 고온에 잘 견디는 품종인 권심을 대상으로 다형성을 조사하였다. 이 중 10개의 EST에서 insertion/deletion 또는 single nucleotide polymorphism을 발견하여 이를 바탕으로 쉽게 이용이 가능한 10개의 다형성 PCR 마커를 개발하였다.
- 아가로스 gel 상에서 DNA 크기 차이를 확인할 수 없었던 나머지 trehalose 관련 유전자 증폭 DNA는 염기서열분석을 통해 SNP or insertion or deletion (in/del) 다형성 유무를 확인하였다. 염기서열 분석은 쏠젠트(주)에 의뢰를 하였으며 얻어진 염기서열을 이용하여 SNP와 in/del 분석은 staden pakage program을 이용하여 수행했다. 발견된 SNPs와 in/del을 대상으로 아가로스 gel 상에서 다형성을 보여줄 수 있도록 새로운 프라이머를 제작하였다.
- 아라비돕시스 trehalose 합성 유전자와 유사한 총 28개의 배추 EST를 NCBI database에서 찾고 고온에 상대적으로 약한 지부품종과 고온에 잘 견디는 품종인 권심을 대상으로 다형성을 조사하였다. 이 중 10개의 EST에서 insertion/deletion 또는 single nucleotide polymorphism을 발견하여 이를 바탕으로 쉽게 이용이 가능한 10개의 다형성 PCR 마커를 개발하였다. 본 연구에서 개발된 trehalose 분자마커는 앞으로 배추 작물에서 환경 스트레스 저항성과 유전적 연관성을 확인하는데 이용될 수 있고 MAS 를 이용한 품종육성에 이용될 수 있다고 기대된다.
- 이용된 방법은 SNP 위치에 특정 제한효소의 인식서열이 있는지 확인하고 이를 이용하여 지부와 권심 사이에 제한효소 인식서열 유무로 다형성 마커를 개발하였다. 예를 들어 TH6의 SNP 염기서열에 있어서 제한효소 RsaI는 지부의 GTAC 염기서열을 인식한다.
- PCR은 93℃에서3분 후 93℃에서 30초, 50℃에서 1분, 68℃에서 3분 과정을 40회 반복하고, 72℃ 7분 후 종료 또는 5 ℃에서 보관되었다. 증폭된 DNA는 2% 아가로스 gel에서 전기영동을 이용해 DNA 조각의 크기를 확인하였다.
- 지금까지 다양한 DNA 마커종류가 개발되어 유전적 다양성 및 유전자 지도 작성 등에 활용되고 있다. 특히 특정한 기능성 유전자를 대상으로 염기서열의 다형성을 확인하고 발견된 SNP를 대상으로 쉽게 검증할 수 있는 기술개발이 시도되고 있는데 본 연구에서는 dCAP 방법을 이용하여 배추작물 지부와 권심 사이에서 trehalose 합성 관련 유전자의 다형성 확인할 수 있는 10개의 분자 마커를 개발하였다. 개발된 마커는 육종가 또는 육종회사에서 PCR로 쉽게 이용이 가능한 마커이고 이는 앞으로 배추작물의 trehalose 합성 관련 유전자가 고온, 저온, 또는 건조 등의 환경 스트레스 저항성 형질과 어떤 연관관계를 가지는지 조사하는데 중요한 자료로 활용될 수 있으며 나아가 환경 스트레스 저항성 배추 품종을 개발하는데 있어서 중요한 육종 도구로써 사용될 수 있다고 생각된다.
- 하지만 권심의 GTAT는 인식하지 못한다. 프라이머는 처음 EST 시작부위와 끝 부위에서 제작한 프라이머를 이용하여 지부와 권심 DNA를 각각 PCR 증폭하고 제한 효소를 처리하여 다형성을 확인하였다(Fig. 2 and Table 2).
- 한국배추게놈소재은행으로부터 분양받은 고온 스트레스에 약한 품종 ‘지부’(‘Chiifu’)와 비교적 강한 ‘권심’(‘Kenshin’) 두 종의 배추 종자를 발아시켜 키운 후 어린잎을 수확하여 -70℃냉동고에 보관한 후 CTAB method를 이용해 DNA를 추출하였다.
- 검색된 EST 중 염기서열이동일한 EST는 제거하였고 남은 총 28개의 trehalose 유전자 관련 EST 후보군을 확보하였다(Table 1). 확보한 EST에 각각의 고유번호를 부여하였으며, 확보한 염기서열을 이용하여 배추 품종간의 차이를 비교하기 위해 각 EST에 양 끝 염기서열을 대상으로 하여 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 각각 제작하였다(Table 1).
대상 데이터
- 애기장대의 trehalose 합성관련 유전자는 크게 두 그룹으로 나누어지는데 trehalose phosphate synthase (TPS) 11개 유전자(at1g78580, at1g16980, at1g17000, at4g27550, at4g17770, at1g68020, at1g06410, at1g70290, at1g23870, at1g60140, at2g18700)와 trehalose phosphate phosphatase (TPP) 10개 유 전자(at1g22210, at1g35910, at1g78090, at2g22190, at4g12430, at4g22590, at4g39770, at5g10100, at5g51460, at5g65140)이다[10]. NCBI에서 확보된 총 21개의 애기장대 trehalose 합성관련 유전자의 염기서열을 이용하여 NCBI에서 제공하는 B. rapa EST 데이터베이스를 검색하였다. 검색된 EST 중 염기서열이동일한 EST는 제거하였고 남은 총 28개의 trehalose 유전자 관련 EST 후보군을 확보하였다(Table 1).
- rapa EST 데이터베이스를 검색하였다. 검색된 EST 중 염기서열이동일한 EST는 제거하였고 남은 총 28개의 trehalose 유전자 관련 EST 후보군을 확보하였다(Table 1). 확보한 EST에 각각의 고유번호를 부여하였으며, 확보한 염기서열을 이용하여 배추 품종간의 차이를 비교하기 위해 각 EST에 양 끝 염기서열을 대상으로 하여 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 각각 제작하였다(Table 1).
데이터처리
- PCR 증폭을 해 얻은 DNA를 쏠젠트(주)에 염기서열분석을 의뢰하였다. 얻어진 염기서열분석 결과는 staden package 프로그램(http://staden.sourceforge.net/)을 이용하여 지부와 권심 간 염기서열을 비교하였다.
이론/모형
- 3. Nucleotide sequence alignment of TH26 and agarose gel analysis of developed TH26 marker using dCAP method. Bold letter indicates polymorphic sites.
성능/효과
- PCR 증폭 때 사용한 최초의 프라이머 목록은 table 1과 같다. 아가로스 gel 상에서 DNA size 차이(예: TH16)와 지부 DNA는 증폭이 되고 권심 DNA는 증폭하지 못하는 dominant 마커 타입인 TH9가 확인되었다(Fig. 1). 따라서 TH9와 TH16 프라이머의 경우는 지부와 권심의 다형성을 확인시켜주는 마커로 바로 사용이 가능하다.
- 3). 이러한 인위적인 프라이머는 특정 DNA만 제한효소 인식 염기서열을 가지게 하여 제작한 프라이머로 다시 PCR을 수행하고 제한효소 처리 후 아가로스 gel 상에서 각각 DNA 크기차이로 지부와 권심 간의 다형성을 확인할 수 있었다(Table 2 and Fig. 3).
- 2) 우선적으로 TH2와 TH5의 SNPs를 대상으로 프라이머의 3‘ 말단 마지막 염기서열 위치에 SNP가 위치하도록 프라이머를 제작하였다. 하지만 TH2의 경우는 대상 DNA와 프라이머의 마지막 서열이 불일치함에도 불구하고 지부와 권심 모두에서 PCR 증폭이 일어나 다형성을 보이는데 실패하였고 TH5의 경우는 권심 DNA만 증폭되어 우성(dominant) 마커로 사용이 가능함을 확인하였다(Table 2). TH2의 경우는 제한효소를 이용하여 SNP를 보이는 마커로 개발하였다.
후속연구
- 특히 특정한 기능성 유전자를 대상으로 염기서열의 다형성을 확인하고 발견된 SNP를 대상으로 쉽게 검증할 수 있는 기술개발이 시도되고 있는데 본 연구에서는 dCAP 방법을 이용하여 배추작물 지부와 권심 사이에서 trehalose 합성 관련 유전자의 다형성 확인할 수 있는 10개의 분자 마커를 개발하였다. 개발된 마커는 육종가 또는 육종회사에서 PCR로 쉽게 이용이 가능한 마커이고 이는 앞으로 배추작물의 trehalose 합성 관련 유전자가 고온, 저온, 또는 건조 등의 환경 스트레스 저항성 형질과 어떤 연관관계를 가지는지 조사하는데 중요한 자료로 활용될 수 있으며 나아가 환경 스트레스 저항성 배추 품종을 개발하는데 있어서 중요한 육종 도구로써 사용될 수 있다고 생각된다.
- 이 중 10개의 EST에서 insertion/deletion 또는 single nucleotide polymorphism을 발견하여 이를 바탕으로 쉽게 이용이 가능한 10개의 다형성 PCR 마커를 개발하였다. 본 연구에서 개발된 trehalose 분자마커는 앞으로 배추 작물에서 환경 스트레스 저항성과 유전적 연관성을 확인하는데 이용될 수 있고 MAS 를 이용한 품종육성에 이용될 수 있다고 기대된다.
- 이러한 경향에 맞춰 본 연구는 육종에 적용이 가능한 스트레스 저항성에 관련 분자마커개발을 위해 배추에서 trehalose 유전자 군의 다형성 마커를 개발하였다. 이를 이용하여 장기적으로 고온 저항성 직접적으로 연관된 DNA마커를 개발하여 내서성 배추품종 육성에 기초연구자료로 활용될 수 있다고 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.