국내 분유 및 영.유아식품에서 분리된 Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii)의 Biofilm 생성 특성 및 내산성 비교 Biofilm Formation and Low pH Viability of Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) Isolated from Powdered Infant Formula and Infant Foods in Korea원문보기
본 연구는 국내에서 시판되고 있는 분유 및 영 유아식품에서 분리한 Cronobacter spp.(Enterobacter sakazakii) 14개 균주의 biofilm 생성 능력, 산성 환경에서의 생장, 용혈성을 관찰하였다. 연구 결과, 14개의 분리균주는 polyethylene에서 biofilm을 생성하였으며 영양성분이 풍부할수록 biofilm을 강하게 생성하였다. 영양성분의 종류에 따른 biofilm 생성 능력 차이는 뚜렷한 경향을 나타내지 않았으며, Cronobacter spp.의 biofilm 생성 능력은 균주별 특성에 의한 것으로 판단된다. 다양한 pH 환경에서 생장 특성을 관찰한 결과, 14개 중 7개의 균주(50%)가 pH 4.1에서도 생장할 수 있어 국외 균주에 비해 내산성이 비교적 낮게 나타났다. 한편 분리된 모든 균주에서 용혈성은 관찰되지 않았다. 본 연구는 국내 영 유아용 식품에서 분리된 Cronobacter spp.의 생리 생화학적 특성을 제시하였으며 이는 향후 Cronobacter spp. 연구 및 관련 식품산업의 저감화 기술 개발에 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구는 국내에서 시판되고 있는 분유 및 영 유아식품에서 분리한 Cronobacter spp.(Enterobacter sakazakii) 14개 균주의 biofilm 생성 능력, 산성 환경에서의 생장, 용혈성을 관찰하였다. 연구 결과, 14개의 분리균주는 polyethylene에서 biofilm을 생성하였으며 영양성분이 풍부할수록 biofilm을 강하게 생성하였다. 영양성분의 종류에 따른 biofilm 생성 능력 차이는 뚜렷한 경향을 나타내지 않았으며, Cronobacter spp.의 biofilm 생성 능력은 균주별 특성에 의한 것으로 판단된다. 다양한 pH 환경에서 생장 특성을 관찰한 결과, 14개 중 7개의 균주(50%)가 pH 4.1에서도 생장할 수 있어 국외 균주에 비해 내산성이 비교적 낮게 나타났다. 한편 분리된 모든 균주에서 용혈성은 관찰되지 않았다. 본 연구는 국내 영 유아용 식품에서 분리된 Cronobacter spp.의 생리 생화학적 특성을 제시하였으며 이는 향후 Cronobacter spp. 연구 및 관련 식품산업의 저감화 기술 개발에 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
We investigated biofilm formation in various media, growth in low pH, and the hemolytic activity of 14 strains of Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) isolated from a variety of foods including powdered infant formula (n=75), infant cereal (n=100), honey (n=30), and other infant foods (n=100) i...
We investigated biofilm formation in various media, growth in low pH, and the hemolytic activity of 14 strains of Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) isolated from a variety of foods including powdered infant formula (n=75), infant cereal (n=100), honey (n=30), and other infant foods (n=100) in Korea. The Cronobacter spp. adhered and formed biofilms on polyethylene, and a greater extent of biofilm was observed in nutrient-rich media. No clear difference in biofilm-forming ability was noted among the media constituents and the pattern of biofilm formation was strain-dependent. Seven strains out of 14 strains (50%) grew at pH 4.1, indicating that the acid resistance of these Cronobacter spp. isolated in Korea was relatively low. Hemolytic activity was not observed in any of the strains. This study provides basic information for the physiological and biochemical characteristics of Cronobacter spp. isolated from a variety of infant foods in Korea.
We investigated biofilm formation in various media, growth in low pH, and the hemolytic activity of 14 strains of Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) isolated from a variety of foods including powdered infant formula (n=75), infant cereal (n=100), honey (n=30), and other infant foods (n=100) in Korea. The Cronobacter spp. adhered and formed biofilms on polyethylene, and a greater extent of biofilm was observed in nutrient-rich media. No clear difference in biofilm-forming ability was noted among the media constituents and the pattern of biofilm formation was strain-dependent. Seven strains out of 14 strains (50%) grew at pH 4.1, indicating that the acid resistance of these Cronobacter spp. isolated in Korea was relatively low. Hemolytic activity was not observed in any of the strains. This study provides basic information for the physiological and biochemical characteristics of Cronobacter spp. isolated from a variety of infant foods in Korea.
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문제 정의
14개 국내 균주의 생리·생화학적 특성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
본 연구는 국내에서 시판되고 있는 분유 및 영·유아식품에서 분리한 Cronobacter spp.(Enterobacter sakazakii) 14개 균주의 biofilm 생성 능력, 산성 환경에서의 생장, 용혈성을 관찰하였다. 연구 결과, 14개의 분리균주는 polyethylene에서 biofilm을 생성하였으며 영양성분이 풍부할수록 biofilm을 강하게 생성하였다.
의 biofilm 생성에 미치는 영향을 분석하고자 lactose, whey, casein 3가지 성분의 비율과 skim milk(Difco)의 농도에 따라 5가지 media를 제조하여 biofilm 생성 능력을 비교하였다. 1:8로 희석된 skim milk의 lactose, whey protein, casein 양을 skim milk 수준으로 맞추기 위하여 lactose(Difco), whey protein concentrate(80%, Danmark Protein, Worthington, OH, USA), casein hydrolysate(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 희석한 skim milk에 첨가하여 제조하였다. 즉, 희석하지 않은 skim milk, 1:8로 희석한 skim milk(1:8), 1:8로 희석한 skim milk에 lactose 첨가(1:8L), 1:8로 희석한 skim milk에 whey 첨가(1:8W), 1:8로 희석한 skim milk에 casein을 첨가(1:8C)한 5가지 media를 제조하여 실험에 사용하였으며, 자세한 성분 비율은 Table 1에 나타내었다.
TSA를 제조하여 121°C에서 15분간 멸균하고 50oC로 냉각시킨 후 배지 부피의 5%에 해당하는 horse blood(SR0048, Oxoid)를 첨가하였다.
Well에 33%(v/v) glacial acetic acid를 300 µL씩 분주하여 crystal violet을 유리시킨 후, microplate reader(VERSAmax, Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 570 nm(OD570)에서 흡광도를 측정하였다.
pH meter(MP220 basic; Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland)를 사용하여 pH 7.2, 4.5, 4.3, 4.1, 3.9인 TSB를 제조(10 M HCl 또는 10 M NaOH 첨가)하고 121.1°C에서 가압 멸균하였다.
본 연구진과의 국외 공동연구에서는(KFDA, 2005) 국외 분리균주(FDA에서 식품 및 환자의 검체로부터 분리한 68개 균주)와 4가지 표준균주(ATCC 12868, 29004, 29544, 51329), 총 72개의 Cronobacter spp. 균주를 사용하여 각 배지에서 biofilm 생성을 측정하였다. 그 결과 본 연구와 마찬가지로 Cronobacter spp.
멸균된 buffered peptone water에 균주를 접종하고 37oC에서하루 동안 비선택적으로 전배양시킨 후 Enterobacteriaceae enrichment broth(Oxoid, Hampshire, England)에서 37°C, 18시간 동안 선택적 증균배양을 실시하였다.
배양액을 Chromogenic Enterobacter sakazakii agar(DFI Formulation, Oxoid)에 획선도말 후 37°C에서 24시간 동안 배양하여 청록색의 집락을 확인하고, 전형적인 성상을 나타낸 양성 집락을 취하여 tryptic soy agar(TSA)에 획선도말하였다.
Cronobacter spp. 배양액을 멸균 백금이로 취하여 획선도말하고 37oC에서 24시간 배양하여 집락 주위에 투명환을 형성하면 양성, 투명환을 형성하지 않으면 음성으로 판정하였다.
분유나 우유의 성분이 Cronobacter spp.의 biofilm 생성에 미치는 영향을 분석하고자 lactose, whey, casein 3가지 성분의 비율과 skim milk(Difco)의 농도에 따라 5가지 media를 제조하여 biofilm 생성 능력을 비교하였다. 1:8로 희석된 skim milk의 lactose, whey protein, casein 양을 skim milk 수준으로 맞추기 위하여 lactose(Difco), whey protein concentrate(80%, Danmark Protein, Worthington, OH, USA), casein hydrolysate(Sigma Chemical Co.
Cronobacter spp.의 내산성을 비교하기 위하여 최적 pH 조건을 포함한 다양한 산성 pH의 배지를 제조하였다. pH meter(MP220 basic; Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland)를 사용하여 pH 7.
Cronobacter spp.의 주요 오염 매개체인 우유 및 분유의 성분을 고려하여 유성분의 양과 종류에 따른 biofilm 생성 능력 실험을 수행하고, 다양한 pH에서의 생장 및 용혈성을 관찰하였다.
배양액을 20 µL씩 접종하였다. 이때 media에 균을 접종하지 않은 것을 음성 대조구로 설정하였다. 수분증발을 방지하고자 plate를 parafilm으로 감싸고 37oC에서 24시간 배양한 후 well의 media를 제거하고, 멸균 증류수 300 µL로 well을 3-4회 세척하였다.
Louis, MO, USA)를 희석한 skim milk에 첨가하여 제조하였다. 즉, 희석하지 않은 skim milk, 1:8로 희석한 skim milk(1:8), 1:8로 희석한 skim milk에 lactose 첨가(1:8L), 1:8로 희석한 skim milk에 whey 첨가(1:8W), 1:8로 희석한 skim milk에 casein을 첨가(1:8C)한 5가지 media를 제조하여 실험에 사용하였으며, 자세한 성분 비율은 Table 1에 나타내었다.
대상 데이터
본 실험에서는 국내에서 유통(2005년)되는 다양한 영·유아식에서 분리된 Cronobacter spp. 14개 균주를 사용하였다. 멸균된 buffered peptone water에 균주를 접종하고 37oC에서하루 동안 비선택적으로 전배양시킨 후 Enterobacteriaceae enrichment broth(Oxoid, Hampshire, England)에서 37°C, 18시간 동안 선택적 증균배양을 실시하였다.
실험에 사용하는 균주를 각각 TSB에 접종하여 37°C에서 12시간 동안 배양하고, 이를 TSB로 100배 희석하여 균희석액을 준비하였다.
실험에 사용할 균주는 TSA에 획선도말하여 37°C에서 18-24시간 동안 배양한 후 냉장 보관하였고, 2주일마다 한 번씩 배양하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복 수행하였으며, SAS program(SAS, Version 8.1, SAS Inst. Inc., 2001, Cary, NC., USA)의 분산분석을 실시하였으며, 유의성 검정은(p<0.05) Duncan의 다중검정법을 이용하였다.
이론/모형
분리균주에 대한 biofilm 생성 실험은 Stepanoviæ 등(Stepanoviæ et al., 2004)의 방법에 의거하여 수행하였으며, 96-well microtiter plate(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하였다.
성능/효과
38 범위로 최대 9배의 차이를 보여 균주마다 biofilm 생성 능력의 차이가 큰 것으로 나타났다. Skim milk를 1:8로 희석한 경우에는 skim milk보다 최소 10, 최대 130, 평균 30배로 흡광도가 크게 감소하였으며, 1:8로 희석한 skim milk+lactose(1:8L), 1:8로 희석한 skim milk+whey(1:8W), 1:8로 희석한 skim milk+casein(1:8C)에서도 skim milk보다 흡광도가 감소하여 biofilm이 약하게 생성되었다. 이러한 결과를 살펴볼 때 Cronobacter spp.
가 polyethylene에 부착하여 biofilm을 생성할 수 있음을 알 수 있었다. Skim milk에서 14개 균주의 흡광도는 2.93-25.38 범위로 최대 9배의 차이를 보여 균주마다 biofilm 생성 능력의 차이가 큰 것으로 나타났다. Skim milk를 1:8로 희석한 경우에는 skim milk보다 최소 10, 최대 130, 평균 30배로 흡광도가 크게 감소하였으며, 1:8로 희석한 skim milk+lactose(1:8L), 1:8로 희석한 skim milk+whey(1:8W), 1:8로 희석한 skim milk+casein(1:8C)에서도 skim milk보다 흡광도가 감소하여 biofilm이 약하게 생성되었다.
는 EPS의 일종인 capsular material을 생성하는 것으로 알려져 있으며(Scheepe-Leberkühne and Wagner, 1986), Iversen 등(2004)은 capsule을 생성하는 Cronobacter spp. 균주가 생성하지 않는 균주보다 높은 밀도의 biofilm을 생성한다는 것을 확인하여 exopolysaccharide capsular material의 생산으로 인하여 미생물의 부착력이 더 강화될 수 있다고 추측하였다. 반면 이와는 대조적으로 capsule이 biofilm의 생산에 영향을 미치지 않거나 저해한다는 연구 결과도 있다(Dancer et al.
의 biofilm 생성 능력은 균주별 특성에 의한 것으로 판단된다. 다양한 pH 환경에서 생장 특성을 관찰한 결과, 14개 중 7개의 균주(50%)가 pH 4.1에서도 생장할 수 있어 국외 균주에 비해 내산성이 비교적 낮게 나타났다. 한편 분리된 모든 균주에서 용혈성은 관찰되지 않았다.
(Enterobacter sakazakii) 14개 균주의 biofilm 생성 능력, 산성 환경에서의 생장, 용혈성을 관찰하였다. 연구 결과, 14개의 분리균주는 polyethylene에서 biofilm을 생성하였으며 영양성분이 풍부할수록 biofilm을 강하게 생성하였다. 영양성분의 종류에 따른 biofilm 생성 능력 차이는 뚜렷한 경향을 나타내지 않았으며, Cronobacter spp.
영양성분의 종류에 따른 차이를 비교하고자 1:8L, 1:8C, 1:8W를 대상으로 유의성 검정을 실시한 결과, 1:8L에서 다른 media보다 유의적으로 biofilm을 강하게 생성하였으며(p<0.05) 다른 media간에는 유의적 차이가 나타나지 않았다.
후속연구
의 생리·생화학적 특성을 제시하였으며 이는 향후 Cronobacter spp. 연구 및 관련 식품산업의 저감화 기술 개발에 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
biofilm 생성과 관련된 문제로 무엇이 있는가?
Biofilm이란 물질의 표면에 미생물이 고착된 군집을 이루어 존재하는 것으로(Castonguay et al., 2006), biofilm을 생성하게 되면 건조, 산화, 살균제, 세척제, 항생제 등과 같은 스트레스에 대한 내성이 증가한다(Albesa et al., 2004; Chang and Halverson, 2003; Hoyle and Costerton, 1991; Iversen et al., 2004). Cronobacter spp.가 식품 공장의 설비나 기구에 biofilm을 생성하면 균의 제어 및 관리가 어려워지므로 생산 단계에서의 지속적인 오염을 초래할 가능성이 있으며, 이는 제품의 안전성에 큰 영향을 미칠 수 있다. 한편 Cronobacter spp.
Cronobacter spp.의 감염 증상은 어떠한가?
Cronobacter spp.는 면역력이 약한 1세 이하의 영아나 생후 28일 이하의 신생아에게 주로 감염되며 수막염, 균혈증, 괴사성 대장염이 주된 증상으로 심각한 경우 사망에까지 이를 수 있다(Arseni et al., 1987; Bar-Oz et al.
Cronobacter spp.의 매개체로 어떤 것이 있는가?
, 2001; Willis and Robinson, 1988). 현재까지 정확한 오염경로는 밝혀지지 않았지만, 질병발생학적 연구를 통하여 조제분유나 우유와 같은 영·유아 식품이 Cronobacter spp.의 주요 매개체로 보고되고 있으며(Biering et al., 1989; Himelright et al., 2002; Iversen and Forsythe, 2004; Weir, 2002), 이 외에도 빵, 우유, 식육, 계란, 채소, 치즈, 향신료, 신선식품 등 다양한 식품(Cabassi et al., 2004; El-Sharoud et al., 2008; Gassem, 1999; Iversen and Forsythe, 2004; Jung and Park, 2006; Lafarge et al., 2004; Soriano et al., 2001)과 병원(Masaki et al., 2001), 식품 공장, 가정(Kandhai et al., 2004)과 같은 환경에서도 분리되고 있다. 분유에서 검출되는 Cronobacter spp.
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