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문제 정의
- 모발 내 melanin 함량의 차이는 melanin 생합성이나 melanosome의 생성과 이동 등 여러 유전적 요인에 의해 발생할 수 있다. 본 연구는 제주흑우와 한우, Holstein 품종에서 출현하는 대표적인 모색과 MC1R 유전자형에 따라 선정된 소들에서 채취한 피부조직에서 melanin 생합성에 직접적으로 관여하는 세 가지 유전자(TYR, TYRP1, DCT)들의 피부조직 내 발현 여부, 품종 간 발현 양의 차이를 조사하고, 이를 품종별 melanin 함량, MC1R 유전자형 등과의 상관관계를 구명하고자 하였다.
- 본 연구는 한우, 제주흑우, Holstein에서 모색 발현 양상과 MC1R 유전자형의 분포에 따라 melanin 합성에 핵심적인 과정에 참여하는 3 가지 유전자(TYR, TYRP1, DCT) 유전자들의 발현 수준의 상호 연관관계를 구명하기 위하여 수행되었다. 반정량 Real-time RT-PCR 분석을 통하여, 세 가지 유전자의 발현 수준을 MC1R 유전자형이 e/e인 한우의 황갈색 부위, E+/E+인 제주흑우의 야생형 흑색 부위, ED/ED인 Holstein의 우성 흑반과 백반부로 대표되는 4 종류의 피부 조직에서 분석하였다.
- 본 연구에서는 melanin 합성 개시인자 중 하나인 αMSH의 신호전달을 매개하는 MC1R의 유전자형이 완전히 구분되는 3 품종, 한우(e/e), 제주흑우(E+/E+), Holstein (ED/ED)에서 melanin 생합성에 관여하는 TYR, TYRP1, DCT 유전자의 발현 양상을 조사하여 이를 3 품종의 모색 양상과 비교하고자 하였다.
제안 방법
- MC1R 296T>C의 결정은 AluI, 311delG (e)는 MspI 제한효소로 공급자의 manual을 따라 37℃에서 overnight 처리한 후 2.5% agarose gel 상에서 전개하여 판독하였다.
- 본 연구는 한우, 제주흑우, Holstein에서 모색 발현 양상과 MC1R 유전자형의 분포에 따라 melanin 합성에 핵심적인 과정에 참여하는 3 가지 유전자(TYR, TYRP1, DCT) 유전자들의 발현 수준의 상호 연관관계를 구명하기 위하여 수행되었다. 반정량 Real-time RT-PCR 분석을 통하여, 세 가지 유전자의 발현 수준을 MC1R 유전자형이 e/e인 한우의 황갈색 부위, E+/E+인 제주흑우의 야생형 흑색 부위, ED/ED인 Holstein의 우성 흑반과 백반부로 대표되는 4 종류의 피부 조직에서 분석하였다. TYR, TYRP1, DCT 유전자 모두 Holstein의 흑반 부위에서 제주흑우의 흑색 부위에 비해 각각 4.
- 소에서 3 가지 대표적인 모색을 나타내는 황갈색 한우, 흑색 제주흑우, 흑백반 Holstein에서 MC1R 유전자형에 따라 melanin 합성에 직접 관여하는 3 가지 효소 TYR, TYRP1, DCT 유전자의 상대적인 발현 수준을 조사하여, 모색 양상과 이들 유전자들의 발현 정도의 상관을 살펴보았다. 하지만, melanin 생합성 대사 유전자의 전사활성을 조절하는 유전자들과 melanin 합성 이후 melanosome의 형성과 이주를 담당하는 유전자들에 대한 연구가 추가된다면, MC1R E+/e 황갈색 한우와 칡소, 백반, 흑반, 이모색 벨트 등 현재까지 밝혀지지 않은 분자유전학적 원인 구명을 위한 자료들이 마련될 것으로 사료된다.
- 유전자형 결정을 위한 PCR 반응은 10× 반응완충액, 20 mM dNTP, 각각 200 mM primer, 1.5 units i-Taq DNA polymerase(Intron Biotechnology, Korea)와 50-60 ng genomic DNA 용액에 멸균한 탈이온수를 첨가하고, PTC-200 (MJ Research, USA)을 이용하여 95℃ 3 분 초기변성 후, 94℃-30 초, 65℃-45 초, 72℃-45 초로 구성된 연쇄반응을 35 회 반복한 후 72℃에서5 분간 최종 신장하였다.
- 채취된 피부조직에서 지방조직과 모발을 제거하였으며, 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 100 mg을 취하여 TRIzol(Invitrogen, USA)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 준비된 RNA 용액은 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies, USA)로 흡광도를 이용하여 농도와 순도를 측정하고, ImPromⅡ Reverse Transcription System(Promega, USA)으로 cDNA를 합성하여 real-time RT-PCR의 주형으로 사용하였다.
- 채취된 피부조직에서 지방조직과 모발을 제거하였으며, 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 100 mg을 취하여 TRIzol(Invitrogen, USA)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 준비된 RNA 용액은 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer(NanoDrop Technologies, USA)로 흡광도를 이용하여 농도와 순도를 측정하고, ImPromⅡ Reverse Transcription System(Promega, USA)으로 cDNA를 합성하여 real-time RT-PCR의 주형으로 사용하였다.
- 피부조직 채취 전 채집한 혈액에서 DNA를 Sucrose-proteinase K 방법을 일부 변형하여 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 한 등[6]의 보고한 MC1R 유전자형 분석 방법을 이용하여 제주흑우, 한우, Holstein의 MC1R 유전자형을 결정하였다. 유전자형 결정을 위한 PCR 반응은 10× 반응완충액, 20 mM dNTP, 각각 200 mM primer, 1.
- 피부조직 채취 전 채집한 혈액에서 DNA를 Sucrose-proteinase K 방법을 일부 변형하여 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 한 등[6]의 보고한 MC1R 유전자형 분석 방법을 이용하여 제주흑우, 한우, Holstein의 MC1R 유전자형을 결정하였다.
- 한우, 제주흑우, 젖소의 흑백반 피부조직에서 TYR, TYRP1 및 DCT 유전자의 상대적 발현양 분석은 SYBR Green qRT-PCR Master Mix (Stratagene, USA)를 이용하여 반응액을 제조하였고, MX3005P real-time PCR system (Stratagene, USA)을 이용하여 유전자별 독립적으로 개체별 2 회 반복 분석하였다. 분석에 이용된 각각의 유전자별 primer와 내부보정용 house keeping 유전자인 GAPDH primer, 그리고 PCR 조건 등은 Guibert 등[5]의 염기서열 및 실험방법을 이용하였으며, 상대적 발현양은 ΔΔCt 방법으로 분석하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 이용된 시료는 농촌진흥청 국립축산과학원 제주 출장소에서 제주흑우와 한우, 젖소 농가에서 Holstein에서 동일 계절에 피부조직을 채취하였다. 한우와 제주흑우의 피부조직은 동일한 위치인 왼쪽 어깨부위에서 채취하였고, 흑/백반인 Holstein에서는 한우, 제주흑우에서 채취한 부위와 가장 인접한 흑모색 및 백반 부위의 피부조직에서 채취되었다.
- 본 연구에 이용된 시료는 농촌진흥청 국립축산과학원 제주 출장소에서 제주흑우와 한우, 젖소 농가에서 Holstein에서 동일 계절에 피부조직을 채취하였다. 한우와 제주흑우의 피부조직은 동일한 위치인 왼쪽 어깨부위에서 채취하였고, 흑/백반인 Holstein에서는 한우, 제주흑우에서 채취한 부위와 가장 인접한 흑모색 및 백반 부위의 피부조직에서 채취되었다.
데이터처리
- 한우, 제주흑우, Holstein 3 품종에서 발견되는 4 가지 모색(황색, 흑색, 진흑색, 백색)을 나타내는 피부조직에서 발현되는 TYR, TYRP1 및 DCT 유전자의 상대적 발현양의 통계적인 유의성의 검정은 SAS프로그램[15]을 이용하였고, Duncan 다중 검정방법으로 유의성을 진단하였다.
이론/모형
- 분석에 이용된 각각의 유전자별 primer와 내부보정용 house keeping 유전자인 GAPDH primer, 그리고 PCR 조건 등은 Guibert 등[5]의 염기서열 및 실험방법을 이용하였으며, 상대적 발현양은 ΔΔCt 방법으로 분석하였다.
성능/효과
- Real-time RT-PCR에서 조사된 유전자의 발현 수준은 3 종류의 유전자 모두 Holstein 흑반>제주흑우>한우>Holstein 백반의 순으로 강하게 발현되는 양상을 보이고 있었다.
- TYR, TYRP1, DCT 유전자 모두 Holstein의 흑반 부위에서 제주흑우의 흑색 부위에 비해 각각 4.5 배, 2.3 배, 2.5 배이상의 유전자 발현 수준을 나타내었다(p<0.001).
- 이러한 결과들은 한우와 제주흑우, Holstein의 흑색 부위의 모색 발현 양상들이 이들 3 가지 melanin 생합성 유전자들의 전사 수준과 직접적인 연관이 있는 것으로 사료되며, 이는 한우 e/e, 제주흑우 E+/E+ Holstein의 ED/ED 등 서로 상이한 MC1R 유전자형의 관여가 반영된 결과로 추정되었다. 결론적으로 본 연구는 MC1R 단백질의 상태가 TYR과 일련의 melanin 합성 주관 유전자들의 전사활성을 유도할 뿐만 아니라 소의 피부에서 총 melanin 함량의 수준을 결정함을 제시하고 있다.
- 310delG에 의한 조기종결과 이로 인해 아미노말단이 결손된 e 대립인자형의 MC1R 단백질들이 αMSH의 신호를 세포내로 전달하는 과정에서 신호증폭에서 상대적인 차이를 나타낸다는 것이다[10]. 또한 그 결과로 melanin 생합성 유전자들의 전사활성을 결정하는 핵 내 전사 인자인 MITF, SOX10 등[3,8,11,19]의 발현수준의 차이가 발생하여 최종적으로 TYR 유전자의 전사 수준이 결정되는 것으로 보인다. 이후 TYR에 의해 melanin 생합성 대사가 개시되어 아미노산의 일종인 tyrosine가 전환되어 만들어진 생성물이 TYRP1과 DCT의 효소활성의 기질이 된다는 차원에서 정상적인 melanin 생합성 과정에서는 이들의 발현 양 TYR 유전자의 발현과 밀접한 상관을 보임은 당연한 결과라 하겠다.
- 또한, 제주흑우의 이들 3 가지 유전자들의 발현 수준은 한우에 비해 유의적으로 높은 수준을 나타내었다(p<0.001).
- Klugland 등[10]은 소 MC1R 유전자의 ED, E+ 및 e의 대립인자가 소의 흑모색 및 적모색 발현과 관련되어 있음을 보고한 바 있다. 본 연구에 이용된 Holstein의 MC1R 유전자형은 ED/ED, 제주흑우는 E+/E+ 유전자형인 개체들로 MC1R 유전자형과 그에 따른 신호 전달 과정에서의 기능적 차이는 이들 melanin 생합성 유전자의 발현과도 관련이 있을 것으로 생각된다. 특히 ED 대립인자의 경우 E+ 대립인자 보다 색소세포 내 melanin 생합성 관련 유전자 발현을 증가시키는 것으로 보인다.
- 001). 이러한 결과들은 한우와 제주흑우, Holstein의 흑색 부위의 모색 발현 양상들이 이들 3 가지 melanin 생합성 유전자들의 전사 수준과 직접적인 연관이 있는 것으로 사료되며, 이는 한우 e/e, 제주흑우 E+/E+ Holstein의 ED/ED 등 서로 상이한 MC1R 유전자형의 관여가 반영된 결과로 추정되었다. 결론적으로 본 연구는 MC1R 단백질의 상태가 TYR과 일련의 melanin 합성 주관 유전자들의 전사활성을 유도할 뿐만 아니라 소의 피부에서 총 melanin 함량의 수준을 결정함을 제시하고 있다.
- 이상의 연구결과는 melanin 생합성에 중요한 역할을 수행하는 TYR, TYRP1과 DCT 유전자의 발현은 동일계통의 모색 일지라도 품종에 따라 또는 모색의 발현 부위에 따라 다르다는 것을 보여주고 있으며, 여기에는 MC1R 유전자형도 모색 표현형에 관여되고 있음을 보여주고 있다. 즉, αMSH와의 결합에 의해 모색발생의 신호가 색소세포 내부로 전달되는 데 있어 p.
- 제주흑우의 TYR, TYPR1와 DCT 유전자의 상대적 발현양은 Holstein에 비해 떨어지지만, 한우에 비해 3 유전자 모두에서 유의적으로 높은 것으로 나타났다(p<0.001).
- 한우와 Holstein 백반 사이의 유전자 발현 수준은 통계적 유의차는 없었으나(p>0.05), 한우에서 TYR, DCT 유전자 발현 수준이 다소 높은 경향을 나타내고 있었으며, TYRP1 유전자 발현 수준은 흑백 Holstein의 백반조직에서 높은 경향을 보이고 있었다.
- 황갈색으로 대표되는 한우와 흑갈색 혹은 흑색의 모색을 나타내는 제주흑우, 그리고 흑백반의 Holstein의 흑색과 백색의 피부 조직에서 TYR, TYPR1 및 DCT 유전자의 상대적 발현은 Holstein 흑모 부위의 피부 조직에서 유의적으로 가장 높은 발현 수준을 보였다(p<0.001).
- 흑백 Holstein의 흑반에서의 유전자 발현 수준은 흑모색 계통인 제주흑우 보다 TYR 유전자 발현은 4.5배, TYRP1 유전자는 2.3 배, 그리고 DCT 유전자는 2.5 배로 높게 나타났다(p<0.001, Fig. 1).
후속연구
- 우리나라에서 사육되고 있는 한우와 제주흑우가 각각 황갈색과 흑색으로 대표되지만, 모색의 범위와 농도 및 채도 측면에서는 다양하게 세분해 볼 수 있다. 때문에 본 연구에서 제시하고 있는 유전자 발현에 대한 정보는 한우 및 제주흑우, 칡소 등 재래소의 계통의 특성화 연구뿐만 아니라, 소에서 모색 표현의 강약을 조절하는 유전적인 요인을 분석하는 데 있어 중요한 기초 자료가 될 것으로 사료된다.
- 하지만 E+/e 유전자형인 황갈색의 한우가 적은 빈도지만 10% 이내에서 보고되고 있으며, 제주흑우에서는 30~40% 정도로 보고되고 있다[1,6,9,13,16]. 본 연구에서는 이들 개체에 대한 분석은 수행되지 않았지만 한우와 제주흑우에서 나타나는 E+/e 유전자형 개체에 대한 추가 비교 분석이 이루어진다면 재래가축의 모색에 대한 유전양식의 구명뿐만 아니라 모색 발현에 대한 생물학적 측면에서도 중요한 자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
- 소에서 3 가지 대표적인 모색을 나타내는 황갈색 한우, 흑색 제주흑우, 흑백반 Holstein에서 MC1R 유전자형에 따라 melanin 합성에 직접 관여하는 3 가지 효소 TYR, TYRP1, DCT 유전자의 상대적인 발현 수준을 조사하여, 모색 양상과 이들 유전자들의 발현 정도의 상관을 살펴보았다. 하지만, melanin 생합성 대사 유전자의 전사활성을 조절하는 유전자들과 melanin 합성 이후 melanosome의 형성과 이주를 담당하는 유전자들에 대한 연구가 추가된다면, MC1R E+/e 황갈색 한우와 칡소, 백반, 흑반, 이모색 벨트 등 현재까지 밝혀지지 않은 분자유전학적 원인 구명을 위한 자료들이 마련될 것으로 사료된다.
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