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문제 정의
- Han 등의 보고들(2008, 2010, 2012)에서 채택되었던 22종의 MS 마커와 9종의 indel marker에 대한 예비 조사에서 최종 선발한 MS 8종과 indel 마커 5종, 제주 흑우의 모색 관련 핵심 유전자인 MC1R 유전자형의 조합을 이용하여 제주 흑우 원종집단 및 실용화 축군에서 친자 확인에 대한 효율성을 시험하고자 본 연구를 수행하였다.
- 본 연구의 목표는 제주 흑우 집단과 제주 흑우 유래의 쇠고기 생산용 실용화 축군에 적용하기 적합한 유전자 마커의 조합을 구축하는 것으로, 기존에 보고된 체계 중에서 논란의 소지가 있는 MS 마커의 이용을 가급적 줄이면서도 유전자 정보력이 충분한 마커 조합을 구축하기 위해 indel 마커의 활용 가능성을 시험하는 데 있다. 소, 돼지를 비롯한 주요 축산물의 동일성 검사와 생산 이력 추적, 품종 판별을 위한 유전자 분석 체계는 MS 마커의 반복수에 대한 유전자형 분석이 주로 활용되고 있으나(Mannen 등, 1993; Arranz 등, 1996; Cho 등, 2003; Ji 등, 2007; Kim 등, 2007; Oh 등, 2007), 반면 MS 마커가 나타낼 수 있는 체세포 돌연변이나 불안정성, 이형 접합성의 획득․상실, 분석 과정에서 종종 오류를 유발하는 효소의 slippage 에 의해 stutter band의 형성 등(Collins 등, 1987; Warren 등, 1989; Ostertag과 Kazazian, 2001; Garay 등, 2004; Chen 등, 2012a, b; Huang 등, 2012; Kim 등, 2012)은 이상의 검사 체계를 보완할 수 있는 tri-, tetra-, oligo-nucleotide repeat MS, minisatellite, VNTR, SNP, indel 마커 등, 유전자 정보량이 다소 적더라도 유전자형의 판독이 보다 명확한 진단 체계와의 혼합 이용이 제기되기도 하였다(Daniels 등, 1998; Kersbergen 등, 2007; Pereira 등, 2009; Phillips 등, 2008; Borsting과 Morling, 2011; Pinto 등, 2013).
제안 방법
- DNA 분리는 Sambrook 등(1989)의 방법을 변형하여 수행하였으며, 분리한 DNA는 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer(NanoDrop Technology, USA)로 흡광도를 측정한 후 A260/A280와 A230/A280이 모두 1.8 이상인 DNA들을 40∼60 ng/ul로 희석하여 PCR 반응의 주형으로 이용하였다.
- MS primer 쌍 중 하나를 FAM, HEX, NED, TAMRA 등으로 5‘-형광 표지하여 multiplex PCR 조합을 구성하여 수행하였다.
- MS, Indel 마커들과 MC1R 유전자형 분석에서 산출된 모든 유전자 좌위에 대한 대립인자 빈도와 이형 접합성(heterozygo- sity : He), 다형 정보량(Polymorphic Information Contents : PIC), χ2 value, P-value, Hardy-Weinberg Equilibrium(HWE), 부권 부정율(Exclusion Probability, PE)을 산출하였다.
- PCR 반응은 50 ng의 genomic DNA 용액에 1 × PCR buffer, 125 mM dNTP, 0.3 Unit HotStart Taq DNA polymerase(Bioneer, Korea), MS marker에 대한 primer들을 첨가하고, 멸균 증류수를 첨가하여 최종 10 ul로 하였다.
- 연구에 이용한 MC1R 유전자형의 결정은 Han 등(2008)의 보고를 따랐다. PCR로 증폭한 MC1R 유전자 절편에 대한 PCR 산물은 Alu I과 Msp I 제한효소를 이용하여 37℃에서 overnight 반응한 후, 2% agarose gel 상에서 전개하여 유전자형을 판독하였다.
- Han 등의 보고(2010)에서는 ISAG의 권장 11 MS 마커들이 포함된 22종의 MS 마커와 제주 흑우의 모색 특성이 반영되어 있는 두 가지 모색 관련 유전자(MC1R, ASIP) SNP 마커의 조합을 기반으로 농가에 보급된 제주 흑우 유래 수정란이식(Embryo Transfer, ET), 인공수정(Artificial Insemination, AI) 송아지들의 검출한 바 있다. 반면, 이 과정에서 MS 마커 분석에서 기 보고된 DNA polymerase의 slippage에 의한 miscounting allele이나 판독 오류의 가능성 때문에 어느 정도 부-모-자의 삼자 간 불일치(trio-mismatch)를 허용하는 결과를 제시하였다.
- χ2 value 는 Yates’ correction을 이용하였고, HWE의 유의성은 Bonferroni correction을 이용하였다. 부권 부정율은 부모에 대한 정보가 전혀 없는 경우(NE-1P), 한쪽 부모를 알고 있을 때 다른한 쪽의 부권 부정율(NE-2P)의 경우, 양친과 자손을 모두 알고 있는 경우(NE-PP)의 부권 부정율, 비혈연 집단 내에서 동일 유전자형을 보유할 수 있는 동일 개체 출현율(NE-1)과 두 형매 사이에서 동일한 유전자형을 보유할 수 있는 형매내 동일개체 출현율(SI) 등을 산출하였다. 유전자형에 대한 정보의 산출과 친자 검정은 CERVUS 3.
- 증폭산물은 5배 또는 10배 희석 후 ET-400R size standard(Amersham Biosciences, USA)와 혼합하여 Megabase 1000 automated DNA Sequencer(Amersham Biosciences, USA) 상에서 전개하고, Genetic Profiler(Amersham Biosciences, USA)를 이용하여 유전자형을 결정하였다. 실험과정의 오차를 줄이기 위해 모든 종모우, 수정란 생산용 공란우들의 유전자형은 3회 이상 반복하여 결정하였다.
- 제주 흑우 원종인 SAES 집단과 LPI 집단에서 조사에 이용된 MS 8종, indel 마커 5종의 다형성을 조사하였다(Table 1). 유전자의 구조상에서 예측할 수 있듯이, indel 마커의 경우는 조사된 모든 마커의 대립인자의 수가 2개로 삽입(insertion)형과 결실(deletion)형으로 구분되었다.
- 조사된 개체들 중 유전자형이 동일한 개체의 확인은 CERVUS package 내 동일성 검사(Identity Analysis) program을 이용하였다. 제주 흑우 집단에서의 친자 확인을 위해 SAES와 LPI에서 관리 중인 임신 가능 연령의 암컷들을 모두 후보 모(candidate mother)로, 수정란 이식과 인공 수정을 위해 정액 채취에 이용된 모든 종모우를 후보 부(candidate father)로 선정하여 친자 검정(Parentage Analysis) program을 이용하여 95% 신뢰 수준에서 검출되는 모든 후모 부모를 찾아낸 후 수정란 이식 및 인공 수정의 판독에 이용하였다. 한편, 농장에서 사육 중인 실용화 축군은 후보 모의 DNA를 확보한 경우는 후보 모에 포함시켰으며, 후보 모의 DNA가 없는 개체는 인공 수정에 이용한 종모우를 검출하였다.
- 준비된 반응액에 대한 PCR 증폭은 PTC-200 thermal cycler (Bio-Rad, USA) 상에서 95℃에서 5분간 초기 변성, 94℃ 45초-annealing 온도에서 75초-72℃ 90초로 구성된 cycle을 35회 반복 수행하고, 72℃에서 10분간 최종 신장하였다. 증폭산물은 5배 또는 10배 희석 후 ET-400R size standard(Amersham Biosciences, USA)와 혼합하여 Megabase 1000 automated DNA Sequencer(Amersham Biosciences, USA) 상에서 전개하고, Genetic Profiler(Amersham Biosciences, USA)를 이용하여 유전자형을 결정하였다. 실험과정의 오차를 줄이기 위해 모든 종모우, 수정란 생산용 공란우들의 유전자형은 3회 이상 반복하여 결정하였다.
- 제주 흑우 집단에서의 친자 확인을 위해 SAES와 LPI에서 관리 중인 임신 가능 연령의 암컷들을 모두 후보 모(candidate mother)로, 수정란 이식과 인공 수정을 위해 정액 채취에 이용된 모든 종모우를 후보 부(candidate father)로 선정하여 친자 검정(Parentage Analysis) program을 이용하여 95% 신뢰 수준에서 검출되는 모든 후모 부모를 찾아낸 후 수정란 이식 및 인공 수정의 판독에 이용하였다. 한편, 농장에서 사육 중인 실용화 축군은 후보 모의 DNA를 확보한 경우는 후보 모에 포함시켰으며, 후보 모의 DNA가 없는 개체는 인공 수정에 이용한 종모우를 검출하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 이용한 제주 흑우 원종 집단은 국립축산과학원 난지축산시험장(Subtropical Animal Experiment Station, National Institute of Animal Science, RDA, SAES)과 제주도축산진흥원(Livestock Promotion Institute, Jeju-do; LPI)에서 보관 중인 genomic DNA를 제공받거나, 말초 혈액에서 분리한 총 155두의 DNA를 이용하였다. 친자 확인을 위한 시험은 SAES에서 2008년부터 2010년까지 생산된 제주 흑우 원종의 후손 24두, SAES와 LPI의 인공 수정 정액을 이용하여 생산한 농가 후손집단(A, 8두; B, 8두; C, 8두)을 이용하였다.
- 분석에 이용한 MS 마커는 Han 등(2010)의 보고에서 제시된 22종에 대한 사전 연구를 통해 8종(TGLA53, TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, DIK4460, DIK3027, BL1134)을 선정하였다(Table 1). MS primer 쌍 중 하나를 FAM, HEX, NED, TAMRA 등으로 5‘-형광 표지하여 multiplex PCR 조합을 구성하여 수행하였다.
- 연구에 이용한 Indel 마커는 Han 등(2012)이 제안한 9종의 마커 중 다형정보량이 0.3 이상인 5종(HW_G01, HW_G04, Indel_16, Indel_29, Indel_32)을 선발하였다(Table 1). 유전자형 결정을 위한 PCR 반응은 50 ng의 genomic DNA 용액에 1 × PCR buffer, 125 mM dNTP, 0.
- 유전자형을 기반으로 한 친자 확인 시험은 SAES 제주 흑우 원종의 후손 24두, SAES와 LPI의 인공 수정 정액을 이용한 농가 후손 집단에서 24두를 이용하였다. 본 연구에서 제안한 MS 8종과 indel 5종, MC1R 유전자형을 이용하여 친자 확인 시험을 수행한 결과 분석에 이용한 제주 흑우 원종 24두는 정확히 후보부집단과 후보 모집단에서 사용된 인공 수정용정액공여자인 종모우와 어미 소를 확인할 수 있었다.
- 친자 확인을 위한 시험은 SAES에서 2008년부터 2010년까지 생산된 제주 흑우 원종의 후손 24두, SAES와 LPI의 인공 수정 정액을 이용하여 생산한 농가 후손집단(A, 8두; B, 8두; C, 8두)을 이용하였다. 인공 수정용 정액을 공급받은 농가에서 제주 흑우 실용화 축군과 비슷한 시기에 출생한 한우 후손을 대조실험을 위한 시료로 이용하였다. DNA 분리는 Sambrook 등(1989)의 방법을 변형하여 수행하였으며, 분리한 DNA는 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer(NanoDrop Technology, USA)로 흡광도를 측정한 후 A260/A280와 A230/A280이 모두 1.
- 본 연구에 이용한 제주 흑우 원종 집단은 국립축산과학원 난지축산시험장(Subtropical Animal Experiment Station, National Institute of Animal Science, RDA, SAES)과 제주도축산진흥원(Livestock Promotion Institute, Jeju-do; LPI)에서 보관 중인 genomic DNA를 제공받거나, 말초 혈액에서 분리한 총 155두의 DNA를 이용하였다. 친자 확인을 위한 시험은 SAES에서 2008년부터 2010년까지 생산된 제주 흑우 원종의 후손 24두, SAES와 LPI의 인공 수정 정액을 이용하여 생산한 농가 후손집단(A, 8두; B, 8두; C, 8두)을 이용하였다. 인공 수정용 정액을 공급받은 농가에서 제주 흑우 실용화 축군과 비슷한 시기에 출생한 한우 후손을 대조실험을 위한 시료로 이용하였다.
이론/모형
- χ2 value 는 Yates’ correction을 이용하였고, HWE의 유의성은 Bonferroni correction을 이용하였다.
- 연구에 이용한 MC1R 유전자형의 결정은 Han 등(2008)의 보고를 따랐다. PCR로 증폭한 MC1R 유전자 절편에 대한 PCR 산물은 Alu I과 Msp I 제한효소를 이용하여 37℃에서 overnight 반응한 후, 2% agarose gel 상에서 전개하여 유전자형을 판독하였다.
- 부권 부정율은 부모에 대한 정보가 전혀 없는 경우(NE-1P), 한쪽 부모를 알고 있을 때 다른한 쪽의 부권 부정율(NE-2P)의 경우, 양친과 자손을 모두 알고 있는 경우(NE-PP)의 부권 부정율, 비혈연 집단 내에서 동일 유전자형을 보유할 수 있는 동일 개체 출현율(NE-1)과 두 형매 사이에서 동일한 유전자형을 보유할 수 있는 형매내 동일개체 출현율(SI) 등을 산출하였다. 유전자형에 대한 정보의 산출과 친자 검정은 CERVUS 3.0.3(Kalinowski 등, 2007)을 이용하였다. 조사된 개체들 중 유전자형이 동일한 개체의 확인은 CERVUS package 내 동일성 검사(Identity Analysis) program을 이용하였다.
- 3(Kalinowski 등, 2007)을 이용하였다. 조사된 개체들 중 유전자형이 동일한 개체의 확인은 CERVUS package 내 동일성 검사(Identity Analysis) program을 이용하였다. 제주 흑우 집단에서의 친자 확인을 위해 SAES와 LPI에서 관리 중인 임신 가능 연령의 암컷들을 모두 후보 모(candidate mother)로, 수정란 이식과 인공 수정을 위해 정액 채취에 이용된 모든 종모우를 후보 부(candidate father)로 선정하여 친자 검정(Parentage Analysis) program을 이용하여 95% 신뢰 수준에서 검출되는 모든 후모 부모를 찾아낸 후 수정란 이식 및 인공 수정의 판독에 이용하였다.
성능/효과
- 대립인자가 가장 많았던 마커는 TGLA 53으로 총 14개의 대립인자가 출현하였고, TGLA126, DIK 3027, BL1134 등 3종의 MS 마커는 5개의 대립인자를 나타내었다. Indel-MS 마커들 전체의 평균 대립 인자의 수는 5.31개, 관찰된 이형 접합자형은 평균 0.679, 예상된 이형 접합자형은 평균 0.652, 다형 정보량의 평균은 0.584로 확인되었다. 전체 13종의 마커 중 TGLA53은 Hardy-Weinberg 평형에서 유의적으로 벗어남을 확인하였다(p<0.
- 반면, A 농장의 또 다른 송아지 한 마리의 경우는 송아지 출생 후 어미 소가 도축된 것으로 확인되어 최종적인 어미 소의 확인은 불가능하였다. 결과적으로 A 농장에서 어미 소가 도축된 경우를 제외하고, 제주 흑우 원종 집단과 실용화 축군 집단에서 시험된 48두는 모두 본 연구에서 개발한 유전자 검사 체계만으로도 99% 이상의 신뢰성이 인정된 수준에서 인공 수정용 정액을 생산한 종모우와 종빈 우를 모두 확인할 수 있었다.
- 38개로 확인되었다. 대립인자가 가장 많았던 마커는 TGLA 53으로 총 14개의 대립인자가 출현하였고, TGLA126, DIK 3027, BL1134 등 3종의 MS 마커는 5개의 대립인자를 나타내었다. Indel-MS 마커들 전체의 평균 대립 인자의 수는 5.
- 유전자의 구조상에서 예측할 수 있듯이, indel 마커의 경우는 조사된 모든 마커의 대립인자의 수가 2개로 삽입(insertion)형과 결실(deletion)형으로 구분되었다. 반면, MS 마커의 경우 잘 알려진 바와 같이 여러 가지 대립인자들이 관찰되었고, 제주 흑우 원종 집단에서 관찰된 MS 마커 8종의 평균 대립인자 수는 7.38개로 확인되었다. 대립인자가 가장 많았던 마커는 TGLA 53으로 총 14개의 대립인자가 출현하였고, TGLA126, DIK 3027, BL1134 등 3종의 MS 마커는 5개의 대립인자를 나타내었다.
- 본 연구에서 제안한 MS 8종과 indel 5종, MC1R 유전자형을 이용하여 친자 확인 시험을 수행한 결과 분석에 이용한 제주 흑우 원종 24두는 정확히 후보부집단과 후보 모집단에서 사용된 인공 수정용정액공여자인 종모우와 어미 소를 확인할 수 있었다. 반면, 농가에서 출생한 제주 흑우 후손 24두들은 인공 수정용 정액을 공급한 종모우는 모두 SAES와 LPI의 종모우인 것으로 확인되었으나, A 농장 송아지 2마리와 B 농장 1마리에서 신뢰도 99% 이상의 구간에서 어미 소로 추정할 수 있는 개체들이 발견되지 않았다. 이들에 대한 농장주의 기록과 대조한 결과, 해당 소들 중에서 A 농장 1두와 B 농장 1두는 모두 외부 다른 농가에서 구입한 것으로 확인되었다.
- 유전자형을 기반으로 한 친자 확인 시험은 SAES 제주 흑우 원종의 후손 24두, SAES와 LPI의 인공 수정 정액을 이용한 농가 후손 집단에서 24두를 이용하였다. 본 연구에서 제안한 MS 8종과 indel 5종, MC1R 유전자형을 이용하여 친자 확인 시험을 수행한 결과 분석에 이용한 제주 흑우 원종 24두는 정확히 후보부집단과 후보 모집단에서 사용된 인공 수정용정액공여자인 종모우와 어미 소를 확인할 수 있었다. 반면, 농가에서 출생한 제주 흑우 후손 24두들은 인공 수정용 정액을 공급한 종모우는 모두 SAES와 LPI의 종모우인 것으로 확인되었으나, A 농장 송아지 2마리와 B 농장 1마리에서 신뢰도 99% 이상의 구간에서 어미 소로 추정할 수 있는 개체들이 발견되지 않았다.
- 연구 결과에서 8종의 MS와 5종의 indel 마커의 조합만으로도 ISAG의 권장 수준 이상의 정보력을 나타내는 조합을 선정할 수 있었으며, 이들의 조합만으로도 제주 흑우와 실용화 축 군에 대한 혈통 관리, 친자 확인이 모두 가능한 수준임을 확인하였다. 생산 이력 추적에 도입하는 부분은 현재의 국가 단위 마커 체계와 비교 평가나 법률적인 검토가 필요한 부분이나, 지역의 브랜드 육성을 위한 인증 체계로써는 충분히 장점을 나타낸다고 하겠다.
- 반면, 농가에서 출생한 제주 흑우 후손 24두들은 인공 수정용 정액을 공급한 종모우는 모두 SAES와 LPI의 종모우인 것으로 확인되었으나, A 농장 송아지 2마리와 B 농장 1마리에서 신뢰도 99% 이상의 구간에서 어미 소로 추정할 수 있는 개체들이 발견되지 않았다. 이들에 대한 농장주의 기록과 대조한 결과, 해당 소들 중에서 A 농장 1두와 B 농장 1두는 모두 외부 다른 농가에서 구입한 것으로 확인되었다. 이후 이들 2마리의 어미소의 혈액을 채혈하여 유전자형을 분석하고, 친자 확인 시험을 다시 수행한 결과는 이들 2마리의 송아지의 어미 소가 맞는 것으로 판독되었다.
- 전체 13종의 마커 중 TGLA53은 Hardy-Weinberg 평형에서 유의적으로 벗어남을 확인하였다(p<0.05).
후속연구
- 생산 이력 추적에 도입하는 부분은 현재의 국가 단위 마커 체계와 비교 평가나 법률적인 검토가 필요한 부분이나, 지역의 브랜드 육성을 위한 인증 체계로써는 충분히 장점을 나타낸다고 하겠다. 아직까지 MS와 indel을 동시에 판독할 수 있는 multiplex PCR 기법의 확립 등 실험적인 보완이 요구되는 실정이나, 본 연구의 결과는 제주 흑우의 품종 인증, 친자 확인, 관련 축산물의 브랜드화 등에 관리 체계 구축에 유용한 자료가 될 것으로 판단된다.
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