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- (A) Effect of pH on the Tod DNA polymerase activity: Tris-HCl (open circles), Glycine- NaOH (closed circles). (B) Effect of temperature on the Tod DNA polymerase activity. (C) Effect of divalent cations, Mg2+ (open circles) and Mn2+ (closed circles) on the Tod DNA polymerase activity.
제안 방법
- Taq(Takara) 와 pfu(Promega) DNA poly- merase를 사용한 PCRe 제조사에서 제시된 방법에 따라수행하였다. PCR 반응이 종료한 후 반응액과 동일 용량의 stop solution(60 mM EDTA and 60 mM NaOH)을 첨가하고 5 |1L의 샘플을 1.0% agarose gel에 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide) 로 염색하여 증폭된 밴드를 확인하였다.
- PCR에 사용한 프라이머는 A-phage DNA를 주형으로 하여 1, 2, 4, 6, 8 kb의 DNA단편을 증폭할 수 있게 설계되었다. 프라이머의 염기서열은 다음과 같다 : primer 1(7131-7153) 5'-GATGAGTTCGrGrCCGrACAACT-3'(forward); primer 2 (8111-8130) 5'-GGCGTACCTTTGTCTCACGG-3'(reverse); primer 3(9111-9131) 5'-TAGCTGTCGTCATAGGACTC-3' (reverse); primer 4(11101-11120) 5'-CTTAACCAGTGC- GCTGAGTG-3'(reverse); primer 5(13121-13140) 5'-CCA- CATCCAIACCGGGnTC-3'(reverse); primer 6(15121-15130) 5'-CGGCGGTAAAGAATGATCCG-3'(reverse).
- Tod 유전자에는 대장균에서 잘 사용되지 않는 rare codon을 다수가지고 있기 때문에 rare tRNA 합성효소가 보강된 codon plus 균주를 사용하였다. Plasmid pJLATOD로 E. coli BL21(DE3) codon plus를 형질전환하고 30ºC에서배양하여 세포 성장이 600nm에서 흡광도가 0.5-0.6에 도달하였을 때 온도를 42ºC로 올려 단백질의 생산을 유도하였다. 배양한 세포를 초음파로 파쇄하고 80ºC에서 20분간 열처리한 후, HiTrap™ Q 컬럼 및 HiPrep™ Sephacryl S- 200 컬럼으로 정제하였다.
- Thermus thermophilus HJ6 균주로부터 DNA polymerase 의 유전자를 클로닝하기 위하여 이미 게놈염기서열이 밝혀진 T. thermophilus HB8과 T. thermophilus HB27의 DNA polymerase 유전자 염기서열을 바탕으로 primer를 설계하고, PCR 기법을 이용하여 DNA polymerase를 암호화하는 것으로 예상되는 유전자를 pGEM-T 벡터에 클로닝한후 효소 생산을 위해 다시 pJLA503 벡터에서브클로닝 하였다. 클로닝 된 유전자의 open reading fhime(ORF)는 2505 bp의 길이로 834 아미노산을 암호화하고 있었다.
- Tod polymerase를 PCR에 적용하기 위하여 재료 및 방법에서 언급한 바와 같이 주형인 X-phage 및 primer 1과 2를사용하여 DNA 중합 활성을 측정하였다. Tod polymerase의 pH 의존성은 pH7.
- 따라서 Tod polymerase의 DNA 신장 활성은 Pfu 보다는 높고 Taq와는 비슷한 결과를 나타내었다. Tod polymerase를 long PCR에 적용하기 위하여 λ-phage를 주형으로 하고 각각 1, 2, 4, 6, 8 kb의 단편을 PCR로 증폭하였다. 그 결과 Tod pblymerase는 1, 2, 4, 6 kb의 DNA 단편은 증폭한(Fig.
- Tod polymerase의 DNA 신장 능력을 기존의 시판중인 Taq 및 Pfu polymerase와 함께 비교하기 위하여, λ-phage DNA를 주형으로 하고 각각 20초, 40초, 60초의 다른 신장조건에서 PCR을 수행하였다. 그 결과 Pfu polymerase는 60 초의 신장시간에서 아주 적은 양의 DNA 단편이 확인되었고, Tod 와 Taq polymerase는 40초와 60초의 신장조건에서비슷한 양으로 증폭된 DNA 단편이 확인되었다 (Fig.
- PCR 조건은 94℃, 5분간의 변성단계를 거쳐 94℃에서 1분, 64℃에서 1분, 72℃에서 1분간을 25회 반복 수행하고 72℃ 에서 5분간 마지막 신장 반응을 수행하였다. 그리고 증폭하려는 DNA 단편의 길이에 따라 신장 반응 시간을 다르게조절하였다. 증폭된 DNA 단편은 densitometry(Gel-Pro Analyzer 3.
- 염기서열을 결정하였다. 또한 온도 감수성 프로모터를 포함하는 pJLA503 벡터시스템[14]을 이용하여 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)와 같은 고가 유도기질의 사용 없이 재조합 DNA polymerase를 생산, 정제하고 본효소의 DNA 중합 활성을 분석하였다.
- 6에 도달하였을 때 온도를 42ºC로 올려 단백질의 생산을 유도하였다. 배양한 세포를 초음파로 파쇄하고 80ºC에서 20분간 열처리한 후, HiTrap™ Q 컬럼 및 HiPrep™ Sephacryl S- 200 컬럼으로 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGES- 분석한 결과, 약 94 kDa 부위에서 DNA polymerase의 밴드가확인되었다(Fig.
- 본 연구에서는 온천수에서 분리한 호열성 Thermus thermophilus HJ6 균주로부터 DNA polymerase 유전자를클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 또한 온도 감수성 프로모터를 포함하는 pJLA503 벡터시스템[14]을 이용하여 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)와 같은 고가 유도기질의 사용 없이 재조합 DNA polymerase를 생산, 정제하고 본효소의 DNA 중합 활성을 분석하였다.
- thermophilus HJ6 유래 DNA polymerase(Tod, Top Of DNA polymerase)의 유전자를 클로닝 하기 위하여 게놈염기서열이 밝혀진 Thermus thermophilus HB8과 HB27의 DNA polymerase 유전자 염기서열을 바탕으로 각각 개시코돈의 상류와 종결코 돈의 하류에 해당흐]는 두 가지 primer(Primer 1: 5'-caggtggccctggagtagcatg- 3', primer 2: 5'-tctaaacggcagggccccccta-3')를 사용호].여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. PCRe Pfu DNA polymerase를 사용하여 약 2.
- 온도 감수성 프로모터 (Tandem promoter)를 포함하는 PJLA503 벡터 시스템을 이용하여 Tod 유전자를 클로닝하고 plasmid pJLATOD로 명명하였다. 여기서 효소 생산을 위한숙주균으로는 E.
- 온도 감수성 프로모터(PR, PL)를 포함하는 발현 벡터 pJLA503[14]에 DNA polymerase 유전자를 클로닝하기 위하여 pGEMTOD plasmid를 주형으로 Primer 3(5'-ctggag- tcatatggaggcgatgctt-3', 밑줄은 Nde I 부위)과 Primer 4(5'- tggaattcctaacccttggcggaa-3', 밑줄은 Eco RI 부위)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 2.
- 투석액은 buffer B 로 평형화된 HiPrep™ Sephacryl S-200 HR 26/60 column (GE Healthcare) 에 로딩하고 buffer B를 이용하여 용출 하였다. 용출된 단백질의 정제도는 SDS-PAGE(10% acrylamide gel)를 통하여 확인하였고, 전기영동 밴드는 coomassie staining으로 확인하였다.
- 0M의 NaC로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출된 획분은 DNA 중합효소 활성을 측정한 후활성이 있는 획분을 모아 Amicon(Milipore) filter로농축한 다음 buffer B(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol)로 투석하였다.투석액은 buffer B 로 평형화된 HiPrep™ Sephacryl S-200 HR 26/60 column (GE Healthcare) 에 로딩하고 buffer B를 이용하여 용출 하였다.
- 그리고 증폭하려는 DNA 단편의 길이에 따라 신장 반응 시간을 다르게조절하였다. 증폭된 DNA 단편은 densitometry(Gel-Pro Analyzer 3.1, MediaCybemetics, MD, USA)를 사용하여정량 분석하였다. Taq(Takara) 와 pfu(Promega) DNA poly- merase를 사용한 PCRe 제조사에서 제시된 방법에 따라수행하였다.
- 5 kb의 DNA 단편을 증폭하였고 pGEM-T 벡터에 클로닝 한 후, pGEMTOD라고 명명하였다. 클로닝된 DNA 단편의 염기서열은 ABI Prism 3700 genetic analyzer (Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다.
대상 데이터
- 이용하여 주줄 하였다. T. thermophilus HJ6 유래 DNA polymerase(Tod, Top Of DNA polymerase)의 유전자를 클로닝 하기 위하여 게놈염기서열이 밝혀진 Thermus thermophilus HB8과 HB27의 DNA polymerase 유전자 염기서열을 바탕으로 각각 개시코돈의 상류와 종결코 돈의 하류에 해당흐]는 두 가지 primer(Primer 1: 5'-caggtggccctggagtagcatg- 3', primer 2: 5'-tctaaacggcagggccccccta-3')를 사용호].여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다.
- Thermus thermophilus HJ6 균주의 염색체는 GeneAllR GENEx Genomic kit(GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea) 를 이용하여 주줄 하였다. T.
- Tod polymerase의 2가양이온에 대한 영향을 검토하기 위해 MgCl2, MnCl2를 사용하였다. Mg2+과 Mn2+에 대한 최적농도는 각각 2.
- 5)를 사용하여 80ºC에서 배양 하였다. 대장균 DH5a와 BL21(DE3) codon plus(Novagen, Inc., San Diego, CA, USA)는 각각 클로닝 및 발현을 위한균주로 사용하였다. 플라스미드 pGEM-T vector(Promega, Madison, WI, USA)는 유전자 클로닝과 염기서열 분석을 위해 사용하였고, pJLA503 플라스미드는 일본 오사카대학 Kanaya연구실에서 분양받은 것으로 단백질 발현을 위해 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 Thermus thermophilus HJ6 균주는 일본의 Arima 온천수에서 분리한 것을 사용하였다 [8]. 분리균주 HJ6은 ATCC medium 697(8g polypeptone, 4 g yeast extract, 4g/L NaCl, pH 7.
- pJLATOD로 명명하였다. 여기서 효소 생산을 위한숙주균으로는 E. coll BL21(DE3) codon plus 균주를 사용하였다. Tod 유전자에는 대장균에서 잘 사용되지 않는 rare codon을 다수가지고 있기 때문에 rare tRNA 합성효소가 보강된 codon plus 균주를 사용하였다.
- 클로닝 된 유전자의 open reading fhime(ORF)는 2505 bp의 길이로 834 아미노산을 암호화하고 있었다. 예상된 분자량은 93, 795 Dalton이고, 등 전점은 6.3이었다 Fig. 1 에서는 클로닝된 유전자로부터 예상되는 아미노산 서열과상동성을 가지는 단백질을 대상으로 alignment를 작성하였다. 클로닝 된 유전자는 Thermus thermophilus HB8(NCBI accession No.
- , San Diego, CA, USA)는 각각 클로닝 및 발현을 위한균주로 사용하였다. 플라스미드 pGEM-T vector(Promega, Madison, WI, USA)는 유전자 클로닝과 염기서열 분석을 위해 사용하였고, pJLA503 플라스미드는 일본 오사카대학 Kanaya연구실에서 분양받은 것으로 단백질 발현을 위해 사용하였다.
이론/모형
- 1, MediaCybemetics, MD, USA)를 사용하여정량 분석하였다. Taq(Takara) 와 pfu(Promega) DNA poly- merase를 사용한 PCRe 제조사에서 제시된 방법에 따라수행하였다. PCR 반응이 종료한 후 반응액과 동일 용량의 stop solution(60 mM EDTA and 60 mM NaOH)을 첨가하고 5 |1L의 샘플을 1.
성능/효과
- Mg?4에 의한 Tod polymerase의 활성은 다른 DNA polymerase의 Mg2+ 이온에 대한 효과와 일치하였다[4]. Mna에 대한 Tod polymerase의 최대 활성은 Mg2*에 대한최대 활청과 비슷하여 대부분의 DNA polymerase가 Mg2+에 대한 낮은 활성을 나타내는 것과 비교하여 상이한 결과를 나탸냈다 (Fig. 3C)[3, 4], Tod polymerase의 KC1 농도에 대한 영향도 검토되었다. KC1 에 대해서는 낮은 농도에서는효소활성에 큰 영향을 미치지 않았지만 10 mM 이상의 농도에서 점차 활성이 감소하여 80 mM 이상에서는 효소 활성이완전히 저해되었다 (Fig.
- 여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. PCRe Pfu DNA polymerase를 사용하여 약 2.5 kb의 DNA 단편을 증폭하였고 pGEM-T 벡터에 클로닝 한 후, pGEMTOD라고 명명하였다. 클로닝된 DNA 단편의 염기서열은 ABI Prism 3700 genetic analyzer (Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다.
- PCR을 수행하였다. 그 결과 Pfu polymerase는 60 초의 신장시간에서 아주 적은 양의 DNA 단편이 확인되었고, Tod 와 Taq polymerase는 40초와 60초의 신장조건에서비슷한 양으로 증폭된 DNA 단편이 확인되었다 (Fig. 4). 따라서 Tod polymerase의 DNA 신장 활성은 Pfu 보다는 높고 Taq와는 비슷한 결과를 나타내었다.
- Tod polymerase를 long PCR에 적용하기 위하여 λ-phage를 주형으로 하고 각각 1, 2, 4, 6, 8 kb의 단편을 PCR로 증폭하였다. 그 결과 Tod pblymerase는 1, 2, 4, 6 kb의 DNA 단편은 증폭한(Fig. 5) 바면, 8 kb의 단편은 증폭하지 않았다(data not shown). 일바적으로 PCR에 널리 사용되는 Pol I family의 Taq poly-merase는 개량된 PCR 조건에서 24 kb까지 DNA 증폭이 가능한 것으로 보고되었고[10], a-family의 Pfu polymerase는실제로 증폭할 수 있는 길이가 2 kb 이하로 알려져 있다.
- 5 mM과 1 nM로 나타났다. 또한 2가 양이온이 없는 조건에서는 활성을 나타내지 않아서 본효소의 DNA 합성 반응에는 2가 양이온을 반드시 요구하는 것으로 나타났다. Mg?4에 의한 Tod polymerase의 활성은 다른 DNA polymerase의 Mg2+ 이온에 대한 효과와 일치하였다[4].
- 이것은 PCR 반응에 K&의 첨가가 필수적인 Taq 및 Tea DNA polymerase[ll]과는 대조적인 반면, Tfi DNA polymerase[3]과는 비슷한 결과를 나타냈다. 이상의 결과에서 PCR 반응을 위한 Tod polymerase 의 최적 buffer 조성은 50mM Tris/HCl(pH9.0), 2.5 mM MgCl2, 0.01% tween-20(빈으 촉진제)로 확인되었다.
- 이상의 결과에서 Tod polymerase는 기존에 널리 시판중인 Taq polymerase와 비슷한 신장 활성을 나타내었고 6 kb 의 긴 DNA 단편을 증폭할 수 있기 때문에 분자생물학, DNA 진단, DNA 지문검사 등에서 PCR 반응에 적용 가능성이 높다고 할 수 있다. 또한 Tod DNA polymerase는 2가양이온 및 KC1 농도와 같은 PCR 조건에서 다른 내열성 DNA polymerase와는 다른 생화학적 특성을 나타내기 때문에 기존의 내열성 DNA polymerase에 의해 잘 증폭되지 않는 PCR 샘플에 사용 가능할지도 모른다.
- AAC46079) 과는 79%의 상동성을나타냈다. 이와 같은 생물정보학 분석을 통하여 T. thermophilus HJ6의 염색체로부터 클로닝 한 유전자는 Pol I family에 속하는 DNA polymerase(Tod, Top Of DNA polymerase)(NCBI accession No. EU708319)를 암호화하는것으로 예상되었다.
- 배양한 세포를 초음파로 파쇄하고 80ºC에서 20분간 열처리한 후, HiTrap™ Q 컬럼 및 HiPrep™ Sephacryl S- 200 컬럼으로 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGES- 분석한 결과, 약 94 kDa 부위에서 DNA polymerase의 밴드가확인되었다(Fig. 2). 이 밴드의 분자량은 DNA polymerase의아미노산 서열에서 계산된 분자량과도 잘 일치하였다.
- 1 에서는 클로닝된 유전자로부터 예상되는 아미노산 서열과상동성을 가지는 단백질을 대상으로 alignment를 작성하였다. 클로닝 된 유전자는 Thermus thermophilus HB8(NCBI accession No. BAD70877) 유래와 Thermus caldophilus (No. AAB81398)의 DNA polymerase와는 각각 98%와 97%의 높은 상동성을 나타냈다. 또한, Themus aquaticus 유래의 DNA polymerase(No.
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