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문제 정의
- 따라서 본 연구는 형태적으로 볼 때는 구분하기가 어려운 팥과 콩의 주요 해충종인 팥나방과 동속 종인 어리팥나방을 PCR-RELP 분자마커를 통해서 판별하는 기술을 소개한다.
제안 방법
- 이후 최종 사슬연장 단계가 추가로 72℃에서 10분간 이뤄졌다. PCR 생성물은 1xTAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 1％ 아가로즈젤로 확인하였다.
- PCR 증폭물은 PCR quick-spin ((주)인트론 바이오테크놀로지, 대전, 한국)을 이용하여 프라이머를 제거시켰고, PCR2.1 TOPO 키트(Invitrogen Carlsbad, CA, USA) 를 사용하여 클로닝벡터에 재조합시켰다. 재조합된 벡터를 (주)마크로젠(서울)에 염기서열 분석을 의뢰하여 받은 자료를 가지고, DNAstar 프로그램(version 5.
- 두 곤충들은 실내에서 보고된(Jung et al., 2007) 방법대로 누대에 걸쳐 사육하였는데, 사료로 당시 보고된 인공사료 조성을 변형하여 제조한 것(아가 13 g, 증류수 800 ㎖, 포도당 10 g, 종합비타민 5 g, ascorbic acid 4 g, sorbic acid 1 g, 섬유소 10 g, 밀배아 10 g, 적두 20 g, 콩가루 75 g, 카세인 10 g, 콜레스테롤 3 g, β-sitosterol 1 g, methyl-p-hydroxybenzoate 1.5 g, aureomycin 0.5 g, fumidil B 0.4 g)을 공급하였고, 사육에 필요한 환경조건은 광주기 15L/9D, 온도 25±1℃, 상대습도 60±10%로 맞추었다.
- 두 종 사이의 교배에는 성을 미리 구분하여 개체별로 분리한 번데기들로부터 갓 우화한 성충들을 이용하였는데, 팥나방과 어리팥나방 암수 성충들을 서로 교차하여 한 쌍씩 폴리스티렌 용기(72×72×100 mm) (SPL Life Sciences, 서울, 한국) 안으로 방사하였고 먹이로는 증류수와 10% 설탕물을 공급하여 같은 사육조건에 두 었다.
- 팥나방은 2004년 8월 말 경기도 수원시 서둔동에 있는 팥포장(37°16'N 126°59'E)에서 꽃 혹은 꼬투리 안에서 가해하고 있는 유충상태로, 어리팥나방은 2008년 7월 3일 전라남도 무안군 청계면 도대리에 있는 콩포장(34°55′N, 126°25′E)에서 콩의 어린 순들을 묶어 가해하고 있는 유충 상태로 채집하였다. 두 종은 Byun et al. (2005)의 보고에 있는 수컷 생식기 형태를 기준으로 동정하여 확인하였다. 두 곤충들은 실내에서 보고된(Jung et al.
- 이 시료를 Rsa I의 제한 효소(Roche, Mannheim, Germany)로 제조회사의 반응 온도조건에 따라 3시간 처리했다. 제한효소 처리물은 1xTAE에서 1.2％ 아가로즈 젤로 분리한 후, ethidium bromide로 염색하고, UV등에서 확인하였다.
- 팥나방과 어리팥나방의 분자마커를 개발하기 위해두 염기서열에서 차이를 보이는 영역을 중심으로 Rsa I의 제한효소 부위를 찾았다(Fig. 2A). 이는 PCR 증폭물은 Rsa I으로 처리할 경우 팥나방의 경우는 388 bp와 117 bp크기의 두 개 절편을 만드는 반면, 어리팥나방은 제한부위을 만들지 못할 것으로 예측되었다.
- 2% 아가로즈젤 상에서는 구분하기 어려웠다. 팥나방과 어리팥나방의 증폭물을 클로닝벡터에 삽입 후, 염기서열을 분석하였다(Fig. 1B). 이 둘 사이에 50 개의 점 돌연변이 부위를 발견할 수 있다.
대상 데이터
- 실험에는 종별로 사육 중인 두 집단들과 두 종 사이의 교배에서 나온 두 종류의 F1 세대 집단들에서 각각 4령 유충들을 임의로 선별하였고, 선별된 유충들은 DNA 추출을 위해 100% 에탄올에 담아 보관하였다.
- 팥나방은 2004년 8월 말 경기도 수원시 서둔동에 있는 팥포장(37°16'N 126°59'E)에서 꽃 혹은 꼬투리 안에서 가해하고 있는 유충상태로, 어리팥나방은 2008년 7월 3일 전라남도 무안군 청계면 도대리에 있는 콩포장(34°55′N, 126°25′E)에서 콩의 어린 순들을 묶어 가해하고 있는 유충 상태로 채집하였다.
- DNA 추출액 1 ㎕, dNTP 5 ㎕, 10x PCR 완충용액 5㎕, 각 프라이머(25 pmol/㎕) 1 ㎕, Taq DNA 중합효소 1 ㎕, 3차 증류수 36 ㎕로 구성되었다. 프라이머와 Taq DNA 중합효소는 (주)바이오니어(대전, 한국)로부터 각각 제작 또는 구입하였다. PCR 반응조건은 초기 94℃에서 1분간 열처리 후, 35 반복의 증폭 단계를 거쳤다.
데이터처리
- 1 TOPO 키트(Invitrogen Carlsbad, CA, USA) 를 사용하여 클로닝벡터에 재조합시켰다. 재조합된 벡터를 (주)마크로젠(서울)에 염기서열 분석을 의뢰하여 받은 자료를 가지고, DNAstar 프로그램(version 5.01, DNAstar Inc., Madison, WI, USA)과 MEGA 4.1 프로그램을 이용하였다.
이론/모형
- 보존형 서열을 중심으로 제작된(Simon et al., 1994) 프라이머인 CI-N-2191 (5'-CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC-'3) 과 CI-J-1751 (5'-GGA TCA CCT GAT ATA GCA TTC CC-'3)을 이용하여 Kim et al., (1998)의 방법으로 증폭하였다.
- 팥나방과 어리팥나방 유충을 일반 게놈 DNA 분리방식(Sambrook et al., 1989)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 시료는 proteinase K 를 처리하고, 이후 페놀추출과 에탄올 침강을 이용하여 순수 DNA를 분리하였다.
성능/효과
- 예상대로 F1은 모계의 종에 따라 제한부위 형태를 나타냈다. 이러한 분자지표를 두종 및 F1에서 각각 임의의 10 개체에 적용하였을 때 동일한 예상 결과를 얻어(미보고자료) 근연종 판별 분자 지표로서 이용 가능성을 제시하였다.
- 이는 PCR 증폭물은 Rsa I으로 처리할 경우 팥나방의 경우는 388 bp와 117 bp크기의 두 개 절편을 만드는 반면, 어리팥나방은 제한부위을 만들지 못할 것으로 예측되었다. 이를 바탕으로 두 종과 이들의 F1의 시토크롬옥시다아제-I을 증폭시키고, Rsa I을 처리한 결과, 예상대로 팥나방은 2개의 절편을 나타냈고, 어리팥나방은 PCR 증폭물 그대로의 모습을 보였다(Fig. 2B). 예상대로 F1은 모계의 종에 따라 제한부위 형태를 나타냈다.
후속연구
- 앞으로 본 연구에서 개발된 분자지표가 종별 먹이식물의 범위를 정확히 측정하는 수단이 될 것으로 예상된다. 또 유충상태로 종구분이 어려울 때, 한 포장에 두 종이 혼재되어 있는 경우 종별 유충 밀도를 실시간으로 판단할 수 없는데, 콩의 경우 기존 보고(Oku et al., 1983)와 같이두 종이 함께 발생할 수 있어, 앞으로 분자지표가 종별 밀도수준을 판단하는 데 기여할 수 있다. 한편 성충의 외부 형태 역시 외관상 구분하기 힘들고, 생식기 모양 차이로도 두 종이 뚜렷하게 종간 격리된 것을 확신할 수 없는 상태이다.
- 두 종은 유충상태에서 외관상 구분되지 않는데(Kobayashi and Oku, 1980). 앞으로 본 연구에서 개발된 분자지표가 종별 먹이식물의 범위를 정확히 측정하는 수단이 될 것으로 예상된다. 또 유충상태로 종구분이 어려울 때, 한 포장에 두 종이 혼재되어 있는 경우 종별 유충 밀도를 실시간으로 판단할 수 없는데, 콩의 경우 기존 보고(Oku et al.
- 한편 성충의 외부 형태 역시 외관상 구분하기 힘들고, 생식기 모양 차이로도 두 종이 뚜렷하게 종간 격리된 것을 확신할 수 없는 상태이다. 이에 앞으로 위 분자지표는 두 종의 성페로몬 연구에서 각 종별 성페로몬을 정확히 동정하고, 대상종의 감각과 비행행동을 이해하는데 이용될 것이다.
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