본 연구에서는 여뀌 추출물의 항산화, 미백, 항주름 효과를 통한 항노화 활성을 조사하였다. 여뀌 추출물의 free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성($FSC_{50}$)은 분획물 중 ethyl acetate 분획에서 $5.23\;{\mu}g/mL$로 가장 큰 활성을 나타내었다. Luminol-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 여뀌 추출물의 총 항산화능은 분획물 중 ethyl acetate 분획($0.40\;{\mu}g/mL$)이 큰 활성을 나타내었다. 여뀌 추출물에 대하여 rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 억제 효과를 측정하였다. 여뀌 추출물의 경우 $1\;{\sim}\;10\;{\mu}g/mL$의 농도에서 광용혈을 억제하였다. 미백 및 주름억제 효과측정으로는 각각 tyrosinase 및 elastase의 활성 저해 효과를 측정하였다. Tyrosinase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)는 aglycone 분획($8.90\;{\mu}g/mL$) 에서, elastase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)도 aglycone 분획($2.37\;{\mu}g/mL$)에서 가장 큰 저해활성을 나타났다. 여뀌 추출물중 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획에 대한 실험 결과로부터 항산화, 항노화 화장품 원료로서의 가능성을 확인하였다.
본 연구에서는 여뀌 추출물의 항산화, 미백, 항주름 효과를 통한 항노화 활성을 조사하였다. 여뀌 추출물의 free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) 소거활성($FSC_{50}$)은 분획물 중 ethyl acetate 분획에서 $5.23\;{\mu}g/mL$로 가장 큰 활성을 나타내었다. Luminol-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$계에서 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 여뀌 추출물의 총 항산화능은 분획물 중 ethyl acetate 분획($0.40\;{\mu}g/mL$)이 큰 활성을 나타내었다. 여뀌 추출물에 대하여 rose-bengal로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 억제 효과를 측정하였다. 여뀌 추출물의 경우 $1\;{\sim}\;10\;{\mu}g/mL$의 농도에서 광용혈을 억제하였다. 미백 및 주름억제 효과측정으로는 각각 tyrosinase 및 elastase의 활성 저해 효과를 측정하였다. Tyrosinase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)는 aglycone 분획($8.90\;{\mu}g/mL$) 에서, elastase의 활성 저해 효과($IC_{50}$)도 aglycone 분획($2.37\;{\mu}g/mL$)에서 가장 큰 저해활성을 나타났다. 여뀌 추출물중 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획에 대한 실험 결과로부터 항산화, 항노화 화장품 원료로서의 가능성을 확인하였다.
In this study, we investigated the antioxidative activity and inhibitory effects on elastase and tyrosinase of Persicaria hydropiper L. extracts. The free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activities ($FSC_{50}$) of ethyl acetate fractions of Persicaria hydropiper L...
In this study, we investigated the antioxidative activity and inhibitory effects on elastase and tyrosinase of Persicaria hydropiper L. extracts. The free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activities ($FSC_{50}$) of ethyl acetate fractions of Persicaria hydropiper L. was $5.23\;{\mu}g/mL$. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of some Persicaria hydropiper L. extracts on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system were investigated using the luminol - dependent chemiluminescence assay. The ROS scavenging activities ($OSC_{50}$) of ethyl acetate fractions of Persicaria hydropiper L. was $0.40\;{\mu}g/mL$. The protective effects of extract / fractions of Persicaria hydropiper L. on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The Persicaria hydropiper L. extracts suppressed photohemolysis in a concentration dependent manner ($1\;{\sim}\;10\;{\mu}g/mL$). Inhibitory effects ($IC_{50}$) on tyrosinase of aglycone fraction of Persicaria hydropiper L. extracts was $8.90\;{\mu}g/mL$. Inhibitory effects ($IC_{50}$) on elastase of aglycone fraction of Persicaria hydropiper L. extracts was $2.37\;{\mu}g/mL$. These results indicate that extract / fractions of Persicaria hydropiper L. can function as antioxidants in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by anti-oxidative activity and protect cellular membranes against ROS. Persicaria hydropiper L. extract / fractions could be used as a new cosmeceutical for whitening and anti-wrinkle products.
In this study, we investigated the antioxidative activity and inhibitory effects on elastase and tyrosinase of Persicaria hydropiper L. extracts. The free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activities ($FSC_{50}$) of ethyl acetate fractions of Persicaria hydropiper L. was $5.23\;{\mu}g/mL$. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) of some Persicaria hydropiper L. extracts on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system were investigated using the luminol - dependent chemiluminescence assay. The ROS scavenging activities ($OSC_{50}$) of ethyl acetate fractions of Persicaria hydropiper L. was $0.40\;{\mu}g/mL$. The protective effects of extract / fractions of Persicaria hydropiper L. on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The Persicaria hydropiper L. extracts suppressed photohemolysis in a concentration dependent manner ($1\;{\sim}\;10\;{\mu}g/mL$). Inhibitory effects ($IC_{50}$) on tyrosinase of aglycone fraction of Persicaria hydropiper L. extracts was $8.90\;{\mu}g/mL$. Inhibitory effects ($IC_{50}$) on elastase of aglycone fraction of Persicaria hydropiper L. extracts was $2.37\;{\mu}g/mL$. These results indicate that extract / fractions of Persicaria hydropiper L. can function as antioxidants in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by anti-oxidative activity and protect cellular membranes against ROS. Persicaria hydropiper L. extract / fractions could be used as a new cosmeceutical for whitening and anti-wrinkle products.
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문제 정의
계)에서의 이들 ROS에 대한 총항산화능에 관한 연구는 아직 되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 화장품 원료로서 사용 가능한 우리나라 여뀌를 구입하여 추출물(혹은 분획)을 제조하고 이들 추출물(혹은 분획)의 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 보호활성, Fe3+-EDTA/H2O2 계에서의 총 항산화능, 미백과 관련 있는 tyrosinase와 피부 주름 생성에서 중요한 역할을 하는 elastase 활성 저해 효과를 측정하였고, 항산화 및 항노화 활성을 가지는 기능성 화장품 소재로서 가능성이 있는지 검토하였다.
가설 설정
5) 피부의 탄력감소 및 주름생성에 있어서 elastase의 활성 감소는 매우 중요하다. 여뀌 추출물의 elastase 저해 활성(IC50)을 측정한 결과 추출물 중 aglycone 분획이 2.
제안 방법
1 mL를 혼합한 후 37 ℃에서 10 min 동안 항온 배양한 다음, 반응혼합물을 얼음수조에 넣어 반응을 종결시키고, 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase를 첨가하지 않은 것을 공시험(blank)으로 하여 효소활성 저해를 계산하였다. 활성의 크기는 0.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한후 15 min 동안 광조사 하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한후 15 min 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 다음 식에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다. 소거 활성은 DPPH의 농도가 50 % 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였다.
대조군(control)은 시료대신 시료용액으로 사용된 용매를 100 µL 첨가하였다.
대조군(control)은 시료용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3⋅6H2O을 첨가하지 않은 것으로 하였다.
이 여액을 감압 건조하여 파우더를 얻고 이를 실험에 사용하였다. 또한 50 % 에탄올 추출물은 감압 농축한 후 물과 hexane을 이용하여 비극성 성분을 제거하고 이후 ethyl acetate 분획을 감압ㆍ농축하여 파우더를 얻었다.
암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal (12 µM) 0.5 mL 를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15 min 동안 광조사 하였다.
Free radical은 노화, 특히 피부노화의 원인 물질로 간주되고 있다. 여뀌 추출물에 대한 free radical 소거활성측정은 DPPH를 이용하였다. 실험방법은 메탄올에 용해시킨 0.
여뀌 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50 %가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
추출물을 농도별로 각각 50 µL씩 첨가하였다.
대조군(control)은 시료용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3⋅6H2O을 첨가하지 않은 것으로 하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널간의 차이가 거의 없도록 하였다. 화학발광으로 측정한 저해율을 다음 식과 같이 나타내었고, 활성산소 소거활성의 크기는 화학발광의 세기가 50 %감소되는데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity, OSC50, µg/mL)로서 표기하였다.
대상 데이터
(+)-α-Tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, EDTA, luminol, heparin, 증감제로 사용된 rose-bengal, free radical 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다.
Ethyl acetate 분획으로부터 aglycone 제조: ethyl acetate 분획에서 얻은 파우더 일부는 산 가수분해 반응을 이용해서 당을 제거시킨 후 얻은 aglycone 파우더를 실험에 사용하였다. 실험 방법은 ethyl acetate 가용분 일정량에 H2SO4 및 acetone 용액을 넣고, 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류⋅냉각시킨다.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia) 사의 Cary 50, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D 는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, pH meter는 Istek (Korea)사 제품을 사용하였다.
완충용액제조에 사용된 Na2HPO4ㆍ12H2O, NaH2PO4ㆍ2H2O, NaCl, 그리고 trizma base, HCl, 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), ethyl acetate(EtOAc) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 기질로 사용된 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide, 효소로 사용된 elastase (0.35 mg protein/mL, 7.8 units/mg protein)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 플라보노이드의 분석에 사용한 thin layer chromatography (TLC)는 aluminum sheet silica gel 60 F254 (0.
기타 FeCl3ㆍ6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
본 실험에서 사용한 Fe3+-EDTA/H2O2계는 각종 ROS(O2•- ,ㆍOH 그리고 H2O2)를 생성시킨다.
플라보노이드 비교물질로 사용한 quercetin, kaempferol, quercitrin, hyperin, isoquercitrin은 Sigma (USA)사에서 구입하였다. 실험 재료인 여뀌는 2008년 6월경 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 107 cells/mL이었다.
(Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다. 완충용액제조에 사용된 Na2HPO4ㆍ12H2O, NaH2PO4ㆍ2H2O, NaCl, 그리고 trizma base, HCl, 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), ethyl acetate(EtOAc) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 기질로 사용된 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide, 효소로 사용된 elastase (0.
적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.
2 mm)로 Merck (USA)사에서 구입하였다. 플라보노이드 비교물질로 사용한 quercetin, kaempferol, quercitrin, hyperin, isoquercitrin은 Sigma (USA)사에서 구입하였다. 실험 재료인 여뀌는 2008년 6월경 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의수준에서 Student’s t-test를 행하였다.
Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 안 했을 경우와 rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120 min까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 4회 반복하여 평균하였다. 상대적인 광용혈 보호 효과는 아래와 같이 나타내었다.
2) 여뀌 추출물의 활성산소 소거활성(OSC50)은 여뀌 50 ％ 에탄올 추출물 2.33 µg/mL, ethyl acetate 분획 0.40 µg/mL, ethyl acetate 분획의 당 제거한 aglycone 추출물은 1.12 µg/mL로 ethyl acetate 분획이 가장 큰 활성을 나타냈다.
3) 1O2으로 유도된 적혈구의 광용혈 현상에 있어서, 여뀌 추출물은 µg/mL의 농도 범위(1 ~ 10 µg/mL)에서 농도-의존적으로 1O2으로 유도된 용혈을 억제하였다.
4) 여뀌 추출물의 멜라닌 생성에 있어서 핵심효소인 tyrosinase 저해 활성(IC50)을 측정한 결과 분획물 중 aglycone 분획은 8.90 µg/mL로 가장 큰 활성을 나타내었으며, 미백관련 화장품 원료로 알려진 arbutin((IC50 :226.88 µg/mL)에 비해 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타내었다.
Ethyl acetate 분획과 aglycon 분획은 비교 물질인 (+)-α-tocopherol과 비교했을 때 free radical 소거활성이 큰 것으로 나타내었다.
대조군(control)은 τ50이 31 min으로 오차범위 ± 1 min 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.
40 µg/mL로 나타났다. 따라서 ethyl acetate 분획의 총항산화능은 50 %에탄올 추출물이나 aglycon 분획보다 큼을 보여주었다. 또한 Ethyl acetate 분획과 aglycon 분획 추출물은 비교 물질로 사용한 L-ascorbic acid (1.
70 µg/mL에 비해서도 큰 elastase 저해활성을 보였다. 또한 50% 에탄올 추출물, ethyl acetate 분획과 aglycone 분획은 비교물질 quercetin에 비해 그보다 더 큰 elastase 저해활성이 보였다(Figure 6).
여뀌 추출물의 elastase 저해 활성(IC50)을 측정한 결과 추출물 중 aglycone 분획이 2.37 µg/mL로 가장 큰 활성을 나타내었으며 비교물질인 oleanolic acid가 89.0 µg/mL인 것에 비해 elastase 억제 효능이 상당히 큰 것을 확인할 수 있었고, 뛰어난 주름개선 효과가 있을 것으로 사료된다.
여뀌의 aglycone 분획은 1, 2.5, 5, 10 µg/mL의 농도에서 τ50이 각각 144.60, 345.0, 391.67, 393.93 min으로 세포 파괴를 억제하였고, 위의 결과에서 보듯이 10 µg/mL의 농도에서 가장 큰 세포보호 효과(393.93 min)를 보여주었다.
후속연구
이상의 결과들은 여뀌 추출물의 항산화 작용과 더불어 여뀌 성분에 대한 분석과 ethyl acetate 분획의 당 제거실험 후 얻어진 aglycone 분획의 tyrosinase, elastase 저해활성으로부터 미백 및 주름개선을 위한 기능성 화장품 원료로서 응용 가능성이 있음을 시사한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
ROS는 무엇인가?
산화적 스트레스는 주 원인이 태양 자외선(UVA 및 UVB)에의 노출이며, 자외선에 의해 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 피부의 항산화제를 압도할 때 일어난다. ROS란 반응성이 매우 큰 1O2 및 ⋅OH를 비롯하여 O2•- , H2O2, ROO⋅, RO⋅, ROOH 및 HOCl 등을 포함한다[1,2]. 이들은 포르피린과 같은 광증감제에 의한 광증감반응 및 몇 가지 효소반응을 포함하는 다양한 과정을 거쳐서 세포 및 조직 중에서 생성될 수 있다[3].
여뀌의 건조한 잎의 추출물에는 플라보노이드가 함유되있는데 어떠한 효능이 있는가?
여뀌의 건조한 잎의 추출물의 주성분으로는 quercetin 3-O-β-L-rhamnoside (quercitrin), kaempferol-3-glucoside, 6-hydroxy-apigenin, galloyl kaempferol 3-glucoside, scutillarein, 6-hydroxyluteolin, 6-hydroxyluteolin-7-O-β-D-glucopyranoside, quercetin 3-O-β-D-glucuronide, galloyl quercetin, quercetin 등이 함유된 것으로 보고되었다[23]. 이러한 플라보노이드가 함유된 여뀌는 항산화 활성과 지질과산화 억제 작용을 하는 것으로 보고되고 있고[24], 또한 항균작용 및 지혈작용을 한다[22].
산화적 스트레스의 주 원인은?
피부는 다양한 환경적 요인(자외선, 공해, 산화제)에의 빈번한 접촉에 기인한 산화적 스트레스에 민감하다. 산화적 스트레스는 주 원인이 태양 자외선(UVA 및 UVB)에의 노출이며, 자외선에 의해 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 피부의 항산화제를 압도할 때 일어난다. ROS란 반응성이 매우 큰 1O2 및 ⋅OH를 비롯하여 O2•- , H2O2, ROO⋅, RO⋅, ROOH 및 HOCl 등을 포함한다[1,2].
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