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문제 정의
- 이전의 연구에서 여뀌의 잎에 대한 성분이 보고된 바 있으나, 본 연구에서는 국내 자생 여뀌의 전초 추출물 중 ethyl acetate 분획 또는 aglycone 분획을 기능성 화장품 소재로서 가능성이 있는지 알아보기 위해 TLC 및 HPLC를 이용한 성분 분석을 실시하였다.
제안 방법
- Ethyl acetate 분획으로부터 aglycone 제조: ethyl acetate 분획에서 얻은 파우더 일부는 산 가수분해 반응을 이용해서 당을 제거시킨 후 얻은 aglycone 파우더를 실험에 사용하였다 실험 방법은 ethyl acetate 가용분 일정량에 H2SO4 및 acetone 용액을 넣고, 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류 . 냉각시킨다.
- HPLC 분석은 2 % acetic acid 수용액과 0.5 % acetic acid를 함유한 50 % acetonitrile 수용액을 기울기 용리법으로 분리하였고, 이때 HPLC 분리조건은 Table 1에 나타내었다. 또한 제조된 aglycone 분말은 100 % 에탄올에 녹이고, syringe filter (Millipore 0.
- 45 “m)를 이용하여 여과하고 이 여 액을 TLC 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다. TLC 분석에서 전개 용매는 ethyl acetate 분획의 경우 ethyl acetate : formic acid : water = 82 : 9 : 5 (v/v) 을 사용하여 분석하였으며, aglycone 분획은 hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v)를 사용하였다. 성분 확인은 이미 보고된 분광학적 자료, 플라보노이드 표준물질의 Rf 값과 자외선 및 발색법을 이용한 분리된 띠의 색상 등으로 확인하였다.
- 여과하고 용매를 감압 . 건조시켜 얻은 띠별 파우더를 분석에 사용하였다. 또한 분리된 TLC 띠 성분 확인에는 UV-visible 흡수스펙트럼, IR 스펙트럼 등 여뀌의 분광학적 데이터들도 이용하였다.
- 이러한 플라보노이드가 함유된 여뀌는 항산화 활성과 지질과산화억제 작용을하는 것으로 보고되고 있고[3], 또한 항균작용 및 지혈작용을 한다[1]. 본 논문에 앞서 저자들은 여뀌 추출물의 항균 작용[4]과 항산화, 미 백, 항주름 효과를 통한 항노화 활성을 조사하였으몌5], 여뀌 추출물을 함유한 크림을 제조하여 인체 피부에서의 보습 효능을 측정하였다[4].
- TLC 분석에서 전개 용매는 ethyl acetate 분획의 경우 ethyl acetate : formic acid : water = 82 : 9 : 5 (v/v) 을 사용하여 분석하였으며, aglycone 분획은 hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v)를 사용하였다. 성분 확인은 이미 보고된 분광학적 자료, 플라보노이드 표준물질의 Rf 값과 자외선 및 발색법을 이용한 분리된 띠의 색상 등으로 확인하였다.
- 여뀌 주출물 중 ethyl acetate 분획과 aglycone 분획을 100 % 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Millipore 0.45 “m)를 이용하여 여과하고 이 여 액을 TLC 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다. TLC 분석에서 전개 용매는 ethyl acetate 분획의 경우 ethyl acetate : formic acid : water = 82 : 9 : 5 (v/v) 을 사용하여 분석하였으며, aglycone 분획은 hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v)를 사용하였다.
- Figure 1는 50 % 에탄올로 주줄 한 여뀌 추출물로부터 얻은 ethyl acetate 분획의 TLC 크로마토그램이며 플라보노이드 배당체들을 분리할 수 있는 조건에서 여뀌의 ethyl acetate 분획은 6의 띠 (PHI, PH2, PH3, PH4, PH5, PH6)로 분리되었다. 이 6 개의 띠가 어떤 플라보노이드인가를 알아보기 위하여, TLC 크로마토그램에서 분리된 띠를 각각 긁어서 추출. 여과하고 용매를 감압 .
대상 데이터
- HPLC는 Dionex사, 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), ethyl acetate (EtOAc) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였으며, 플라보노이드의 분석에 사용한 thin layer chromatography (TLC)는 aluminum sheet silica gel 60 F254 (0.2 mm)로 Merck (USA)사에서 구입하였다 플라보노이드 비교물질로 사용한 quercetin, kaempferol, quercitrin, hyperin, isoquercitrine Sigma (USA) 사에서 구입하였다. 실험 재료인 여뀌는 강원도 홍천군에서 채취한 것을 2008년 6월경 경동시장에서 구입하여사용하였다.
- 건조시켜 얻은 띠별 파우더를 분석에 사용하였다. 또한 분리된 TLC 띠 성분 확인에는 UV-visible 흡수스펙트럼, IR 스펙트럼 등 여뀌의 분광학적 데이터들도 이용하였다. 그 결과 Figure 1에서 용출된 PH2, 3, 4, 5, 6 은 모두 당 제거반응에서 quercetin으로 확인되었다.
- 2 mm)로 Merck (USA)사에서 구입하였다 플라보노이드 비교물질로 사용한 quercetin, kaempferol, quercitrin, hyperin, isoquercitrine Sigma (USA) 사에서 구입하였다. 실험 재료인 여뀌는 강원도 홍천군에서 채취한 것을 2008년 6월경 경동시장에서 구입하여사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의수준에서 Student's £-test를 행하였다.
성능/효과
- 1) 여뀌 주줄물 중 ethyl acetate 분획의 TLC는 6개의 띠(PH1 ~ PH6)로 분리되었고, 그 중에서 Rf 0.52인 PH 4의 농도가 가장 진한 것으로 나타났다.
- 2) 여뀌 주출물 중 ethyl acetate 분획 에 대하여 당 제거 실험 후 얻어진 aglycone 분획의 TLC는 2개의 띠 (PHa-1 ~ PHa-2)를 나타내었고, 이때 PHa-1, PHa-2 는 각각 kaempferol과 quercetin으로 확인되었다.
- 3) Aglycone 분획에 대한 HPLC 크로마토그램은 2개의 피이 크를 나타냈고 그 용리 순서는 quercetin, kaempferol 이 었으며, quercetin의 함량이 가장 큰 것으로 나타났다.
- 4) 여뀌 주출물 중 ethyl acetate 분획의 HPLC 크로마토그램은 검출파장 360 nm에서 7개의 피이크를 나타내었고, peak 1은 quercetin 3-0- P -D-galactoside, peak 2 는 quercetin 3-0- -D-glucoside, peak 3는 quercetin 배당처L peak 4는 quercetin 3-0- 0 -L-rhamnoside, peak 5 는 quercetin 배딩치], peak 6는 quercetin, peak 7는 kaempferole. 확인되었다,
- 결론적으로 이미 보고된 여뀌 추출물의 항균, 항산화, 항노화 작용 및 보습 효능평가와 더불어 여뀌 추출물에 대한 성분 분석은 새로운 기능성 화장품원료로서 웅용가능성이 있음을 시사한다.
- 건조시킨 후 얻은 파우더를 에탄올 용액으로 하여 HPLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. 그 결과 Figure 1의 TLC (normal phase) 크로마토그램에서 PHI (Rf 0.92)은 Figure 3의 HPLC (reverse phase) peak 6과 peak 7로, PH3는 peak 4, PH 5는 peak 2, PH6은 peak 1 일치 함을 확인하였다. 또한 Figure 1와함께 표준 물질을 사용하여 peak 1 (7.
- 크로마토그램이다. 이 aglycone 분획은 2개의 띠 (PH a-1, PH a-2)로 분리되었고, 표준물질을 이용하여 확인한 결과 PH a-1은 quercetin으로 확인되었고, PH a- 2는 kaempferol로 확인되었다. 한편, ethyl acetate 분획을 당 가수분해시켜서 얻은 aglycone 분획에는 플라보노이드 배당체는 존재하지 않았다.
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