선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이러한 배경 하에 본 실험실에서는 dopaminergic신경 세포에 과도한 DA의 산화로 인한 파킨슨병에 보호 효과를 가지는 우수한 천연 자원을 탐색하여 보고자 neuronal cell death의 모델로 널리 사용되는 human SH-SY5Y neuroblastoma cell을 이용하였으며 과도한 DA을 처리하여 cell death를 일으켰다. 그리고 다양한 생약 추출물들을 대상 시료로 하여 DA 처리 24시간 전에 human SH-SY5Y neuroblastoma cell에 처리함으로써 각 시료들의 neuroprotective effects를 FACs analysis를 통해 확인하였다.
제안 방법
- 모든 시료는 duplicate로 측정하여 평균값을 산출하였고 cell viability(%)는 100(%)-세포 apoptosis율(%)로 나타냈다. Cell viability로부터EC50(The term half maximal effective concen-tration)의 값을 table curve 프로그램을 이용하여 계산하였다.
- SH-SY5Y Cell의 DA 농도 별 cell viability − 6-well plate에 3.0×105 cells/well로 배양한 뒤 48시간 후 SH-SY5Y cell에 DA를 각각 200, 400, 600, 800, 1000 µM의 농도로 처리하였다.
- 이러한 배경 하에 본 실험실에서는 dopaminergic신경 세포에 과도한 DA의 산화로 인한 파킨슨병에 보호 효과를 가지는 우수한 천연 자원을 탐색하여 보고자 neuronal cell death의 모델로 널리 사용되는 human SH-SY5Y neuroblastoma cell을 이용하였으며 과도한 DA을 처리하여 cell death를 일으켰다. 그리고 다양한 생약 추출물들을 대상 시료로 하여 DA 처리 24시간 전에 human SH-SY5Y neuroblastoma cell에 처리함으로써 각 시료들의 neuroprotective effects를 FACs analysis를 통해 확인하였다. 또한 부위별로 성분 차이가 많이 나는 생약 추출물들은 부위별로 추출하여 각 부위별 효과를 측정하였다.
- # H8502, USA) 처리 24시간 전에 선행 처리하였으며 각 추출물 시료들의 효과는 EC50 값을 지표로 하여 비교 관찰하였다. 그리고 양성 대조군은 파킨슨병 치료제로 널리 보고된 Apomorphine9-12)으로 선정하여 각 시료들의 EC50 값과 비교하여 neuroprotective effects를 비교하였다. 시료 및 Apomorphine은 10% dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, cat.
- 그리고 다양한 생약 추출물들을 대상 시료로 하여 DA 처리 24시간 전에 human SH-SY5Y neuroblastoma cell에 처리함으로써 각 시료들의 neuroprotective effects를 FACs analysis를 통해 확인하였다. 또한 부위별로 성분 차이가 많이 나는 생약 추출물들은 부위별로 추출하여 각 부위별 효과를 측정하였다.
- 시료의 전처리 − 시료는 100, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032 µg/ml의 농도 별로 DA 600 µM (Sigma-Aldrich, cat.# H8502, USA) 처리 24시간 전에 선행 처리하였으며 각 추출물 시료들의 효과는 EC50 값을 지표로 하여 비교 관찰하였다.
- 천마(Gastrodia elata)등 24종 45가지의 생약과 부위별 성분 차이가 많이 나는 종의 각 부위별 MeOH 추출물을 대상으로 하였으며, 몇몇 시료들은 한방 원리에 의해 약효가 달라지는 심을 제거한 겉껍질(거심)을 사용하거나, 볶아서 사용하거나(초), 다른 시료들(음건)과 달리 햇볕건조, 또는 술에 담근 후 말려서 볶는(주초)등의 방법으로 각각의 효과를 알아보았다. 이들 각각의 시료가 과도한 DA에 의해 손상을 입은 human SH-SY5Y neuroblastoma cell 에서 갖는 뇌 보호 효과는 EC50값을 지표로 하여 비교해 보았다. 각 생약시료 및 Apomorphine을 각각 100, 20, 4, 0.
- 이를 1000 rpm에서 5분간 원심 분리 하고 PBS로 씻어 준 후, 40 µg/ml의 Propidium Iodide (PI, Sigma-Aldrich, USA)로 암실에서30분간 염색하고 유세포 분석기 (FACS, Coulter EPICS XL, USA)로 세포 apoptosis율을 측정하였다.
- 천마(Gastrodia elata)등 24종 45가지의 생약과 부위별 성분 차이가 많이 나는 종의 각 부위별 MeOH 추출물을 대상으로 하였으며, 몇몇 시료들은 한방 원리에 의해 약효가 달라지는 심을 제거한 겉껍질(거심)을 사용하거나, 볶아서 사용하거나(초), 다른 시료들(음건)과 달리 햇볕건조, 또는 술에 담근 후 말려서 볶는(주초)등의 방법으로 각각의 효과를 알아보았다. 이들 각각의 시료가 과도한 DA에 의해 손상을 입은 human SH-SY5Y neuroblastoma cell 에서 갖는 뇌 보호 효과는 EC50값을 지표로 하여 비교해 보았다.
대상 데이터
- Cell culture − human SH-SY5Y neuroblastoma cell (ATCC no. CRL-2266)은 10% fetal bovine serum (Gibco-BRL, cat.#16000-044, USA) 및 antibiotics (Sigma-Aldrich, cat.# A5955, USA)가 함유된 Dulbecco’s modified eagle’s medium (Sigma-Aldrich, cat.# D2902, USA) 배지 하에서 배양하였다.
- 생약의 추출 및 시료 조제 − 실험에 사용된 생약시료들은 한국식물추출물은행에서 MeOH 추출물로 구입하여 한국 식물 추출물 은행의 정확한 감정을 거친 후 실험에 사용하였으며 voucher specimen은 자생 식물 사업단에 보관되어 있다.
- 양성 대조군으로는 pure compound인 Apomorphine을 사용하였으며 EC50값은 4.3 µg/ml가 나왔다.
성능/효과
- 1) 과도한 양의 DA는 dopaminergic신경 세포에서 Monoamine oxidase (MAO)-B, Tyrosinase 또는 자가 산화에 의해서 신경 독성 대사물질인 DA quinone 을 생성하게 된다.2) DA quinone은 dopaminergic 신경 세포에 직접 산화적 스트레스로 작용하거나, 파킨슨병과 관련이 있는 여러 중요한 단백질들 (tyrosine hydroxylase, α-synuclein, parkin 과 DA transporter 등)과 결합하여 quinoprotein 을 형성하여 결과적으로 그 단백질들의 기능을 억제3-8)하기 때문에 이 DA quinone이 파킨슨병의 중요한 병인의 하나로 여겨지고 있다.
- 0×105 cells/well로 배양한 뒤 48시간 후 SH-SY5Y cell에 DA를 각각 200, 400, 600, 800, 1000 µM의 농도로 처리하였다. DA처리 24시간 후 FACs analysis를 통해 농도별 세포의 apoptosis율을 측정하였고 cell viability(%)는 100(%)-apoptosis율(%)로 나타냈다. DA 농도는 위 실험 결과를 토대로 cell viability 값이 44.
- 각 생약시료 및 Apomorphine을 각각 100, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032 µg/ml의 농도로 cell viability를 test한 결과 6가지의 추출물에서 농도 구배에 맞게 효과를 보여 Human SH-SY5Y Neuro-blastoma cell에 과도한 DA으로 유도되는 손상에 대한 보호 활성을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- Apoptosis가 일어난 세포는 PI 염색 강도가 감소하여 일반세포와 비교할 수 있다. 모든 시료는 duplicate로 측정하여 평균값을 산출하였고 cell viability(%)는 100(%)-세포 apoptosis율(%)로 나타냈다. Cell viability로부터EC50(The term half maximal effective concen-tration)의 값을 table curve 프로그램을 이용하여 계산하였다.
후속연구
- 이 중 두충(Eucommia ulmoides) (barks)은 볶아서 사용한 초에서 효과를 보여, 앞으로 볶아서 사용한 경우와 그렇지 않은 경우의 세부 분획물의 성분 차이나 볶은 후의 독성 감소등과 관련된 세부 실험을 진행할 예정이다. 그리고 석창포(Acorus gramineus)는 항 우울효과17), NMDA receptor 관련 neroprotective 효과18)와 excitotoxic neuronal death 억제 효과19) 등이 보고 되고 있어 향후 항우울제, 알츠하이머병, 파킨슨병 등 여러 뇌신경 관련 질환에 효과적인 치료제로 활용할 수 있을 것으로 본다. 그래서 본 연구소에서는 석창포(Acorus gramineus)의 세부 분획 추출물에 대한 효과를 연구 중에 있으며 파킨슨병 동물모델에서의 효과 또한 연구 중에 있다.
- 또한 본 연구실에서 선행 연구를 통해 동물모델에서 효과가 입증된 시료 농도인, 10 µg/ml 보다 낮은 농도에서 EC50 값의 효과를 보여준 생약시료들은 동물모델에서의 효과가 있을 것으로 예상 되어 파킨슨병의 동물 모델로 널리 쓰이는14-16) 6-hydroxydopamine으로 유도된 rat 동물모델에도 적용하고자 한다.
- 위 시료들이 추출물 상태임을 감안하면 앞으로의 세부 분획물의 효과 연구에서는 양성대조군 Apomo-rphine의 EC50값인 4.3 µg /ml보다 낮은 농도에서 EC50값의 효과를 볼 것으로 기대된다.
- 이 중 두충(Eucommia ulmoides) (barks)은 볶아서 사용한 초에서 효과를 보여, 앞으로 볶아서 사용한 경우와 그렇지 않은 경우의 세부 분획물의 성분 차이나 볶은 후의 독성 감소등과 관련된 세부 실험을 진행할 예정이다. 그리고 석창포(Acorus gramineus)는 항 우울효과17), NMDA receptor 관련 neroprotective 효과18)와 excitotoxic neuronal death 억제 효과19) 등이 보고 되고 있어 향후 항우울제, 알츠하이머병, 파킨슨병 등 여러 뇌신경 관련 질환에 효과적인 치료제로 활용할 수 있을 것으로 본다.
- 천마(Gastrodia elata)등 24종의 생약과 부위별 성분 차이가 많이 나는 종의 각 부위별 MeOH 추출물을 대상으로, 이들 시료가 각각의 농도 별로 과도한 DA에 의해 손상을 입은 neuronal cell에서 갖는 neuroprotective effects를 cell viability를 지표로 검색한 결과, 적복령(Poria cocos) (whole), 천마(Gastrodia elata) (rhizomes), 두충(Eucommia ulmoides) (초)(barks), 우산나물(Syneilesis palmate) (whole), 석창포(Acorus gramineus) (rhizomes), 광나무(Ligustrum japonicum)(leaves)등 6가지 생약 추출물들이 농도 구배에 맞게 효과를 보여 주어 향후 파킨슨병 치료제 개발을 위한 후보물질로 제시될 가능성을 보여주었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.