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문제 정의
- 이 연구의 목적은 경남지역의 돼지 사육농가를 대상으로 PRCV에 대한 항체분포를 조사하여 역학적 자료를 분석하고, TGEV와 신속하고 정확하게 감별할 수 있는 진단법을 확립하여 농가 예방대책을 수립함으로써 돼지사육농가의 피해를 최소화하는데 있다.
제안 방법
- 2006년 8월에서 12월까지 경남지역 14개 시·군 양돈농가 중 사육규모가 500두 이상인 37농가를 대상으로 130일령에서 150일령 사이의 돼지를 농가당 5내지 13두씩 총 391두를 채혈하여 ELISA법으로 PRCV/TGEV 항체검사를 실시한 다음, 항체를 보유하고 있는 20농가를 대상으로 호흡기도말시료 등을 채취하여 PCR법으로 항원 감별진단법을 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 3. PRCV와 TGEV를 감별진단하기 위하여 2쌍의 sense 및 antisense primer를 설계하였으며 PCR법을 이용하여 감별진단이 가능하였다.
- PCR: PRCV 와 TGEV를 감별진단하기 위하여 PCR 을 실시하였다. 즉, reverse transcription (RT) 반응으로 생산된 first-strand cDNA 또는 DNA 추출액 10μl에 5X PCR buffer 10μl, 10mM dNTP mixture 1μl, 20pm sense primer 1μl, 20pm antisense primer 1μl, go Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA) 1μl를 순서대로 가하여 최종 반응액의 양을 50μl로 하였다.
- PCR에 의하여 증폭된 DNA를 ethidium bromide (10mg/ml)를 첨가한 1.5% agarose gel에 전기영동하여 gel 판독기(Bio-Rad, USA) 상에서 DNA를 확인하였다.
- PRCV와 TGEV는 동일 혈청에 대하여 동시에 중화 반응을 나타내며 유전적으로도 약 95~98%의 상동성을 보이고 있어, 이 실험에서는 유전적으로 차이를 보이는 부위를 활용한 PCR 및 ELISA 감별진단법으로 검사하였다.
- Primers: Primer는 GenBank (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institute of Health, USA)에 등록되어 있는 porcine respiratory coronavirus 표준주인 AR310, IA1894, ISU-1주와 transmissible gastroenteritis virus 표준주인 Purdue, Miller주의 염기서열을 검색한 다음 (주) Bioneer에서 제공되는 Primer design tool을 활용 하여 2쌍의 sense 및 antisense primer를 제작하였다.
- Virus RNA 추출: PRCV 및 TGEV의 total RNA는 채취한 호흡기도말시료, 분변, 폐조직의 10% 유제액을 3회 동결 융해하고 8,000rpm에서 3분간 원심 분리한 다음 상청액 300μl를 취하여 RNeasy Mini kit (Quia-gen, USA)를 이용하여 추출하였다.
- cDNA 합성: 수거한 호흡기도말시료, 분변, 폐조직에서 추출된 RNA에 대한 First-strand cDNA를 생산하기 위하여 Superscript III reverse transcriptase kit (Invitrogen, USA)를 이용하였다. 즉, 추출된 RNA 16.
- 검사결과의 유효성을 위하여 TGEV/PRCV 음성대조의 흡광도가 0.5 이상인 plate의 성적만을 인정하여 결과를 판독하였다. 가검혈청흡광도의 음성대조흡광도에 대한 억제율(percent inhibition, PI) 값이 60이상인 경우 양성으로, 45이하인 경우 음성으로 판정하였다.
- 경남지역의 돼지 사육농가를 대상으로 ELISA법을 이용하여 PRCV와 TGEV의 항체검사를 실시하였으며 결과는 Table 1과 같다. 경남지역 총 37농가 중 29농가 (78.
- 다음으로 PRCV와 TGEV를 감별진단하기 위해 Table 3과 같이 oligonucleotide primers를 선정하였으며 primer는 TGEV에는 존재하나 PRCV에는 결손된 부위를 감별 진단할 수 있는 2쌍의 sense 및 antisense primer를 설계하였으며 primer 부착 부위는 Fig. 1과 같다. PRCV 및 TGEV 유전자 검출을 위해 ELISA 항체검사에서 PRCV 항체를 보유하고 있는 농가를 대상으로 해당농가 사육 돼지가 도축장에 출하될 때 도축장에서 호흡기도말시료, 분변, 폐장조직 총 150건을 채취하여 PRCV 및 TGEV 유전자 검출을 실시하였으나 Table 4와 같이 모든 시료가 음성으로 판정되었다.
- 세척과정을 거친 후 각 well에 50μl의 Substrate Solution 을 분주하여 실온에서 30분간 반응시키고 반응을 정지시키기 위해 50μl의 Stop Solution을 각 well에 분주한 다음 450nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 계산하였다.
- 이 혼합액을 thermocycler (Biometra, Germany)에서 95°C에서 5분간 predenature시키고 이어서 94°C에서 1분간 denaturation, 60°C에서 1분간 annealing 및 72°C에서 1분간 polymerization 반응을 1cycle로 하여 35cycles 실시하였고, 최종적으로 72°C에서 5분간 extension 반응을 하였다.
- 즉, reverse transcription (RT) 반응으로 생산된 first-strand cDNA 또는 DNA 추출액 10μl에 5X PCR buffer 10μl, 10mM dNTP mixture 1μl, 20pm sense primer 1μl, 20pm antisense primer 1μl, go Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA) 1μl를 순서대로 가하여 최종 반응액의 양을 50μl로 하였다.
- 즉, 추출된 RNA 16.5μl에 reverse primer 1μl를 가하고 5분 동안 끓인 후, 얼음에서 냉각시키고 여기에 5X first strand synthesis buffer 6μl, 0.1M DTT 2.5μl, 10mM dNTP mixture 2μl, RNasin 1μl 및 supRTase III 1μl를 차례로 혼합하여 30μl의 반응액을 만든 후 20°C에서 5분, 50°C에서 40분, 95°C 에서 5분간 반응시켰다.
- 혈청은 원심 분리 후 -20°C에 보관하여 사용하였으며 TGEV 항원이 코팅된 microplate를 각 well당 300μl씩의 Tween이 함유된 세척용액으로 3회 세척한 다음, 1 : 2로 희석된 혈청 100μl를 microplate에 두 well씩 분주하여 37°C에서 120분간 반응시켰다.
대상 데이터
- 2006년 8월에서 12월까지 경남지역 14개 시·군 돼지 사육농가 중 사육규모가 500두 이상인 37농가를 대상으로 130일령에서 150일령 사이의 돼지를 농가당 5내지 13두씩 총 391두를 채혈하여 공시하였다.
- 항체검사를 실시한 농가 중 PRCV 항체를 보유하고 있는 20농가를 대상으로 사육돼지 도축장 출하시 도축장에서 호흡기도말시료, 분변, 폐조직 등 총 150건을 채취하여 항원검사에 공시하였다.
이론/모형
- 돼지호흡기코로나바이러스(PRCV)에 대한 항체분포를 조사하기 위한 효소면역반응(ELISA)은 Transmissible Gastroenteritis Virus/Porcine Respiratory Coronavirus Differentiating Test Kit (TGEV/PRCV-Ab, Svanova Biotech., Sweden)를 사용하였다. 혈청은 원심 분리 후 -20°C에 보관하여 사용하였으며 TGEV 항원이 코팅된 microplate를 각 well당 300μl씩의 Tween이 함유된 세척용액으로 3회 세척한 다음, 1 : 2로 희석된 혈청 100μl를 microplate에 두 well씩 분주하여 37°C에서 120분간 반응시켰다.
성능/효과
- 1. PRCV 항체검사 결과는 농가별로 37농가 중 29농가가 양성(78.4%)이었으며 개체별로는 391두 중 182두가 양성(46.5%)이었다.
- 2. TGEV에 대한 항체검사 결과 37농가 중 모돈에 TGEV 백신을 실시하였던 1농가만 양성(2.7%)이었으며 나머지 36농가는 모두 음성으로 판정되었다.
- 2006년 8월에서 12월까지 경남지역 14개 시·군 양돈농가 중 사육규모가 500두 이상인 37농가를 대상으로 130일령에서 150일령 사이의 돼지를 농가당 5내지 13두씩 총 391두를 채혈하여 ELISA법으로 PRCV 항체검사를 실시한 결과 농가별로 37농가 중 29농가가 양성(78.4%)이었으며 개체별로는 391두 중 182두가 양성(46.5%)이었으며 이러한 결과는 Chae 등(2000)이 발표한 PRCV 항체검사 결과와 비교하여 경남지역의 PRCV 항체양성률이 증가하였음을 알 수 있다.
- PRCV 항체검사 결과 개체별 항체형성률을 시군별로 보면 거제 19.2%, 고성 50.8%, 김해 50.0%, 마산 76.1%, 밀양 50.0%, 양산 64.0%, 진주 55.0%, 진해 30.0%, 창원 40.0%, 통영 30.8%, 하동 60.0%, 함안 50.0%였으며 사천과 산청은 모든 개체가 음성으로 판정되었다.
- 5 이상인 plate의 성적만을 인정하여 결과를 판독하였다. 가검혈청흡광도의 음성대조흡광도에 대한 억제율(percent inhibition, PI) 값이 60이상인 경우 양성으로, 45이하인 경우 음성으로 판정하였다.
- 다음으로 PRCV 및 TGEV 바이러스 분리를 위해 PCR을 실시하였으나 유전자 검출을 실시한 20농가 150건 모두 음성으로 판정되어 바이러스는 검출되지 않았는데, 이 실험에서는 PRCV 감염에 의한 것으로 판단되는 항체 양성 농가를 대상으로 시료를 채취하였으며 이 농가들이 도축을 목적으로 돼지를 출하 하였을 때 도축장에서 호흡기도말, 분변, 폐장조직을 채취하여 시료로 공시하였음에도 불구하고 바이러스가 검출되지 않은 것은 시료를 채취한 시기가 적절하지 못한 데 기인하는 것으로 판단된다. Bernard 등(1986)과 van Nieuwstadt 등(1988)은 초유를 먹이지 않은 자돈에 순화된 TGEV를 구강으로 투여하였을 경우 접종 3일째부터 바이러스가 검출되기 시작하여 2~4일간 지속된다는 결과를 보고하였다.
- 한편 TGEV에 대한 항체검사 결과는 37농가중 모돈에 TGEV 백신을 실시하였던 1농가만 양성(2.7%)이었으며 나머지 36농가는 모두 음성으로 판정되었다. 경남지역의 대부분의 농가에서는 2006년부터 TGEV에 대한 백신을 실시하지 않고 있으며 일부 농가에서만 선택적으로 백신을 접종하고 있는 실정인데, 자체적으로 TGEV 백신을 접종하였던 1농가를 제외하고 모든 농가에서 TGEV 항체가 검출되지 않은 검사결과는 경남지역 돼지 사육농가의 질병관리 수준이 일제히 향상 되어 TGE가 근절된 것인지 혹은 다른 요인이 발생되었는지 정확히 밝힐 수는 없으나 해외에서 보고되었던 자료를 참고로 유추해 보면, 유전적으로 유사한 PRCV 의 확산이 TGEV 면역에 부분적으로 기여하였던 것으로 추정된다.
- 현재까지 우리나라에서 PRCV에 대한 백신을 사용 하지 않고 있는 실정인데 검사에 공시된 혈액에 PRCV 에 대한 항체가 형성되어 있다면 이 개체들이 바이러스에 감염이 되었던 것으로 추정할 수 있으므로, 본 실험에서 검출된 항체는 감염에 의한 항체로 판단되며 경남지역에서 PRCV 항체 양성농가가 78%를 넘는 것으로 보아 경남지역 양돈농가 전역에 PRCV가 확산되어 있는 것으로 추정된다. 그러나 현재까지 돼지호흡기코로나바이러스 감염증에 의한 질병 피해가 보고된 사례는 없으며, 이 바이러스의 병원성이 바이러스주의 독력과 환경적인 요인에 따라 다르게 나타나기 때문인 것으로 사료된다.
후속연구
- PRCV 바이러스를 분리·동정하기 위해서는 바이러스에 감염된 발병 초기의 돼지에서 시료를 채취하여야 할 것으로 사료된다.
- 앞으로 PRCV에 대한 지속적인 연구를 실시하여 농가 현장에서 활용 가능한 신속진단법을 확립할 필요가 있으며, PRCV와 TGEV간의 감별진단법 연구와 더불어 유전적 연관성에 대해서도 면밀히 파악하고, 이러한 연구 결과를 바탕으로 병원성이 약한 병원체를 이용하여 병원성과 경제적 피해가 매우 큰 다른 질병을 막아내는 방법을 제시하는 등 역학적 자료를 방역관리에 활용함으로써 축산농가와 축산업에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
- 유럽의 경우 PRCV에 대한 백신을 실시하고 있으나 우리나라에서는 현재까지 PRCV에 대한 백신을 사용 하지 않고 있는 실정인데 PRCV에 대한 항체가 형성 되어 있다면 바이러스에 감염 되었던 것으로 추정할 수 있으므로 PRCV에 대한 항체유무 조사 결과를 바탕으로 바이러스 분포 여부를 검토할 수 있을 것으로 사료된다.
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