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문제 정의
- , 2009). 따라서 본 연구에서는 lentiviral transfection에 의한 outbred strain에서 확립된 다분화능 정원줄기세포주의 형질전환과 배아 내 주입을 통한 키메라의 생산을 통해 전분화능을 확인하고 유전자변형동물의 생산 가능성을 밝혀보고자 하였다.
- 본 연구에서는 coat color의 확인을 통해 유전자변형동물의 생산가능성을 확인하기 위해 ICR strain에서 유래된 다분화능 정원줄기세포를 BDF1 hybrid 생쥐의 배아와 섞어 주었다. 따라서 ICR strain의 배아에 주입되어 outbred strain의 유전자변형동물의 생산은 시도하지 못했고, strain과 inbred/outbred 간의 생산효율의 직접적인 비교도 시행할 수 없었다.
제안 방법
- 2-세포기 배아를 채취하기 위해 5 IU pregnant mare’s serum gonadotropin(PMSG; Sigma)와 5 IU human chorionic gonadotropin(hCG; Sigma)를 48시간 간격으로 4주령 B6D2F1 strain 생쥐의 복강 내에 주사하여 과배란을 유도한 뒤 B6D2F1 strain 수컷과 합사시키고, 다음 날 아침 질전을 확인하였다.
- 다분화능 정원줄기세포를 이용한 유전자변형동물의 생산 가능성을 확인하기 위해서 체외배양을 통해 2-세포에서 8-세포기로 발생한 배아에 형질이 전환된 다분화능 정원줄기세포를 미세주입하였다. 8-세포기 배아를 holding pipette으로 잡고 위란강(perivetelline space)내에 injection pipette을 이용하여 10개 전후의 줄기세포를 주입하였다. 주입이 완료된 배아는 배아배양액에 4%의 배아줄기세포 배양액이 첨가된 배양액에서 배반포기까지 발달시키고(Ramirez et al.
- 2-세포기 배아를 채취하기 위해 5 IU pregnant mare’s serum gonadotropin(PMSG; Sigma)와 5 IU human chorionic gonadotropin(hCG; Sigma)를 48시간 간격으로 4주령 B6D2F1 strain 생쥐의 복강 내에 주사하여 과배란을 유도한 뒤 B6D2F1 strain 수컷과 합사시키고, 다음 날 아침 질전을 확인하였다. hCG 주사 후 48시간째에 난관을 채취하여 modified human tubal fluid medium(HTF; Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA) 내에서 난관의 팽대부를 통한 관류법으로 배아를 회수하였다. 배아의 기본배양액으로 Quinn’s Advantage Cleavage medium(SAGE In-Vitro Fertilization, Inc.
- 다분화능 정원줄기세포를 이용한 유전자변형동물의 생산 가능성을 확인하기 위해서 체외배양을 통해 2-세포에서 8-세포기로 발생한 배아에 형질이 전환된 다분화능 정원줄기세포를 미세주입하였다. 8-세포기 배아를 holding pipette으로 잡고 위란강(perivetelline space)내에 injection pipette을 이용하여 10개 전후의 줄기세포를 주입하였다.
- 다분화능 정원줄기세포와 배아 줄기세포의 배양에는Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) high glucose (Hyclone, Logan, UT, USA)에 20% Knockout serum replacement(KSR, GIBCO, Grand Island, NY, USA)와 1x nonessential amino acid(GIBCO), 50 ㎛ β-mercaptethanol(GIBCO), 100 U/㎖ penicillin(Hyclone), 100 ㎍/㎖ streptomycin(Hyclone), 103 U/㎖ ESGRO(Chemicon, Temecula, CA, USA)가 포함된 배양액을 사용하였고, 모든 줄기세포 배양은 100% 습도와 5% CO2, 37℃가 유지되는 배양기 내에서 진행되었다.
- 다분화능 정원줄기세포의 유전자변형동물의 생산효율을 비교하기 위해서 태어난 산자의 수와 키메라의 비율을 배아 줄기세포의 결과와 비교하였다. 다분화능 정원줄기세포를 넣은 배아로부터 태어난 산자는 47마리(4.
- )에 blocking하였다. 미분화 세포의 특성 확인을 일차항체로 rabbit polyclonal anti-Nanog(1:50, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), mouse monoclonal anti-Oct4(1:200, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 를 4℃에서 17～24시간 동안 처리하였다. 2차 항체로는 Alexa flour 555Ⓡ goat anti-rabbit IgG(H+L)(1:400, Invitrogen, Eugene, OR, USA), Cy3Ⓡ goat anti-mouse IgG(H+L)(1:200, Invitrogen을 사용하였다.
- Viral pellet을 배양액으로 희석한 후 다분화능 정원줄기 세포의 배양액에 첨가하였다. 배양 48시간 후에 GFP의 발현을 형광현미경 하에서 관찰하였다. 바이러스는 배양액을 교체하기 전까지 5% CO2와 37℃에서, 배양액을 교체하고 회수하기 전까지는 10% CO2와 37℃ 온도 하에서 배양하였다.
- Inc)의 배아로부터 회수된 내세포괴(inner cell mass)로부터 분리, 배양하여 사용하였다. 생쥐의 미분화 다분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포는 0.1% 젤라틴(Sigma Chemical Co. St Louis, MO, USA)이 코팅된 배양접시 위에 mitomycin-C(Sigma)가 처리된 mouse embryonic fibroblast(MEF) 세포 위에서 배양하였으며, 3～4일마다 새로운 MEF 위로 계대배양을 하였다. 다분화능 정원줄기세포와 배아 줄기세포의 배양에는Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) high glucose (Hyclone, Logan, UT, USA)에 20% Knockout serum replacement(KSR, GIBCO, Grand Island, NY, USA)와 1x nonessential amino acid(GIBCO), 50 ㎛ β-mercaptethanol(GIBCO), 100 U/㎖ penicillin(Hyclone), 100 ㎍/㎖ streptomycin(Hyclone), 103 U/㎖ ESGRO(Chemicon, Temecula, CA, USA)가 포함된 배양액을 사용하였고, 모든 줄기세포 배양은 100% 습도와 5% CO2, 37℃가 유지되는 배양기 내에서 진행되었다.
- 1)를 사용하였고, packaging 벡터로는 pMDLg/pRRE를, envelop으로는 pCMV-VSV-GRSV-Rev를 사용하였으며, 4인산2칼슘 침전법을 이용했다. 세 플라스미드를 packaging 세포가 있는 완충액에서 4인산2칼슘 침전법으로 침전시키고 16시간 이후 배양액을 교체하였다. 48시간 후에 다시 상층배양액을 회수하여 이를 0.
- 연구의 진행에 앞서 연구에 사용될 GFP 유전자가 형질전환된 다분화능 정원줄기세포와 GFP-발현 생쥐의 배아줄기 세포의 특성을 확인하기 위해 전분화능 줄기세포의 마아커인AP activity와 Nanog, Oct4 유전자의 발현을 분석하였다(Fig. 2). 형질전환된 다분화능 정원줄기세포는 GFP단백질의 발현을 보였으며, 전분화능 줄기세포의 마아커인 AP의 높은 activity와 높은 Nanog, Oct4 유전자의 발현을 관찰할 수 있었다.
- 또한 전분화능의 또 다른 마아커인 alkaline phosphatase(AP; Sigma-Aldrich)도 염색하였다. 염색이 완료된 세포는 형광현미경(NIKON Eclipse TE-2000 U, Nikon, Tokyo, Japan) 하에서 관찰하였다.
- 1 ㎍/㎖ KaryoMAX colcemid(Invitrogen)를 처리하여 2시간 배양하고, 37℃에서 저장액(1% sodium citrate)에 30분간 처리한 후 Carnoy 고정액(3:1 methanol : acetic acid)에 resuspension 하여 4℃에 보관하였다. 염색체의 분석은 전문검사 기관(네오딘의학연구소, Seoul, Korea)에 의뢰하여 수행하였다.
- , 2009). 유전자변형동물의 생산 가능성을 연구하기 위한 모델로서 본 연구진은 lentivirus system을 이용하여 outbred strain에서 확립된 다분화능 정원줄기세포를 형질전환하였다.
- 형질전환동물의 생산가능성을 분석하기 위해서 GFP가 발현하는 생쥐의 다분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포를 미세조작기를 이용하여 8-세포기 배아에 주입하고, 배아이식을 통해 형질전환된 배아와 키메라 생쥐를 얻고자 하였다. 줄기세포의 주입이 끝난 배아는 추가로 2일간의 배양을 통해 포배로 발생을 유도하였고, 이 과정에서 주입한 세포의 생존율을 높이기 위해 배아 배양액에 줄기세포의 배양액을 4% 추가하여 배양하였다. 주입된 줄기세포가 배아의 내세포괴에 재구축(reconstuction) 되었는지를 세포 주입 후 24시간째에 확인하였으며, 배아 이식 전 배반포기의 내세포괴에 형광이 발현되는 것을 확인하였다(Fig.
- 5 dpc의 ICR strain 생쥐 대리모 자궁 내로 이식하였다. 키메라 생쥐의 형질전환을 확인하기 위해 임신 18일에 회수된 태아와 정상 분만된 생쥐를 이용하여 조직절편을 제작하였고, anti-GFP antibody(Millipore)를 이용한 후 염색하여 관찰하였다.
- 형질전환동물의 생산가능성을 분석하기 위해서 GFP가 발현하는 생쥐의 다분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포를 미세조작기를 이용하여 8-세포기 배아에 주입하고, 배아이식을 통해 형질전환된 배아와 키메라 생쥐를 얻고자 하였다. 줄기세포의 주입이 끝난 배아는 추가로 2일간의 배양을 통해 포배로 발생을 유도하였고, 이 과정에서 주입한 세포의 생존율을 높이기 위해 배아 배양액에 줄기세포의 배양액을 4% 추가하여 배양하였다.
대상 데이터
- ) 를 4℃에서 17～24시간 동안 처리하였다. 2차 항체로는 Alexa flour 555Ⓡ goat anti-rabbit IgG(H+L)(1:400, Invitrogen, Eugene, OR, USA), Cy3Ⓡ goat anti-mouse IgG(H+L)(1:200, Invitrogen을 사용하였다. 그리고 핵의 대조 염색을 위해 DAPI (Chemicon)를 1:500으로 희석하여 사용하였다.
- The blastocysts which incorporated with GFP-positive ES cells under UV-light (A) and bright field (B). The chimeric mice were produced from the ESCs- (C) and mSSCs-injected embryos (D). (E) The organs from ESC-derived chimeric mouse were visualized under UV-light.
- 2차 항체로는 Alexa flour 555Ⓡ goat anti-rabbit IgG(H+L)(1:400, Invitrogen, Eugene, OR, USA), Cy3Ⓡ goat anti-mouse IgG(H+L)(1:200, Invitrogen을 사용하였다. 그리고 핵의 대조 염색을 위해 DAPI (Chemicon)를 1:500으로 희석하여 사용하였다. 또한 전분화능의 또 다른 마아커인 alkaline phosphatase(AP; Sigma-Aldrich)도 염색하였다.
- 배아의 기본배양액으로 Quinn’s Advantage Cleavage medium(SAGE In-Vitro Fertilization, Inc., Tumbull, CT, USA)과 potassium simplex optimization medium-amino acids(KSOM/AA, Millipore)을 사용하였다.
- 본 연구는 동결보관되어 있던 5일령 ICR strain 생쥐의 태아(fetus)의 정소로부터 유래된 다분화능 정원줄기세포주(CHAmSSC-1, Passage No.6)를 공급받아 해동 후 배양하여 진행 하였다(Kim et al., 2009). 유전자변형동물의 생산 가능성을 연구하기 위한 모델로서 본 연구진은 lentivirus system을 이용하여 outbred strain에서 확립된 다분화능 정원줄기세포를 형질전환하였다.
- 본 연구에 사용된 실험동물은 항온 및 항습이 유지되면서 낮밤(낮 12시간, 밤 12시간)이 조절되는 사육실에서 사육하였다. 동물 실험은 차의과학대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 진행하였다.
- 연구에 사용된 lentiviral 벡터는 Hiroyuki Miyoshi 박사(Riken Tsukuba Institute, Ibaraki, Japan)로부터 공여 받은 CS-CDF-CG-PRE 플라스미드(Fig. 1)를 사용하였고, packaging 벡터로는 pMDLg/pRRE를, envelop으로는 pCMV-VSV-GRSV-Rev를 사용하였으며, 4인산2칼슘 침전법을 이용했다. 세 플라스미드를 packaging 세포가 있는 완충액에서 4인산2칼슘 침전법으로 침전시키고 16시간 이후 배양액을 교체하였다.
데이터처리
- 배아이식 후 생산되는 산자와 그 중 키메라 생쥐의 생산효율의 비교는 Chi-square 검정을 이용하였으며, P<0.05인 경우를 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
성능/효과
- 다분화능 정원줄기세포를 넣은 배아로부터 태어난 산자는 47마리(4.8%)로 67마리(11.7%) 가 태어난 배아줄기세포를 넣은 배아에 비해서 산자 생산효율이 낮았다(P0.05, Table 1).
- 일반적으로 outbred strain으로부터 배아줄기세포의 확립은 그 효율이 매우 낮아 이들 종에서의 형질전환을 통한 유전자변형동물의 생산에는 많은 어려움이 있다. 따라서 본 연구를 통한 outbred strain의 생쥐로부터 다분화능 정원줄기세포주의 확립과 이들의 형질전환을 통한 유전자변형동물의 가능성의 확인은 배아줄기세포를 이용할 경우 특정 strain에서만 제한적으로 생산 가능한 유전자변형 생쥐의 생산이 많은 종으로의 확대를 가능케 한다는 점에서 큰 의미가 있다. 실제로 다른 연구자들의 연구 결과에 의하면 생쥐의 strain마다 배아줄기세포를 확립할 수 있는 효율이 다르며, 서로 다른 특성을 가진다(Kawase et al.
- 4E). 또한 다분화능 정원 줄기세포를 넣은 배아로부터 태어난 산자를 whole section 하여 anti-GFP 항체로 염색한 결과 근육, 위, 뼈 등에서 발색되는 것을 확인하였다(Fig. 4F).
- 또한 연구의 대조군으로 사용된 GFP-발현 생쥐의 배아줄기세포 역시 전분화능 세포의 마아커에 강한 발현을 보였다. 또한 다분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포는 연구에 사용된 각각 29계대와 10계대에서 정상적인 핵형을 가지고 있음을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 형질전환된 다분화능 정원줄기세포는 GFP단백질의 발현을 보였으며, 전분화능 줄기세포의 마아커인 AP의 높은 activity와 높은 Nanog, Oct4 유전자의 발현을 관찰할 수 있었다. 또한 연구의 대조군으로 사용된 GFP-발현 생쥐의 배아줄기세포 역시 전분화능 세포의 마아커에 강한 발현을 보였다. 또한 다분화능 정원줄기세포와 배아줄기세포는 연구에 사용된 각각 29계대와 10계대에서 정상적인 핵형을 가지고 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 배아줄기세포 유래의 키메라 생쥐의 장기들에서 형질전환을 확인한 결과, 췌장, 심장, 뇌, 근육, 위, 피부, 정소에 GFP가 발현되는 것을 확인하였다(Fig. 4E). 또한 다분화능 정원 줄기세포를 넣은 배아로부터 태어난 산자를 whole section 하여 anti-GFP 항체로 염색한 결과 근육, 위, 뼈 등에서 발색되는 것을 확인하였다(Fig.
- 본 연구를 통해 outbred strain으로부터 확립된 다분화능 정원줄기세포도 inbred strain에서 확립된 배아줄기세포와 다분화능 정원줄기세포와 마찬가지로 전분화능을 가지고 있으며, 배아 내로 주입되었을 때 키메라 생쥐의 생산이 가능하여 유전자변형동물의 생산이 가능함을 확인할 수 있었다. 따라서 실제로 생식계통으로 전이가 되는 형질전환동물의 생산을 위한 추가의 연구가 절실하다.
- 본 연구에 사용된 outbred strain에서 유래된 다분화능 정원줄기세포는 배아줄기세포에 비해 산자의 생산에 기여하는 바가 낮았다. 하지만 태어난 산자 중에 키메라의 생산효율은 배아줄기세포에 비해 별다른 차이가 없었다.
- Kanatsu-Shinohara 등(2004)은 정자를 생산하는 미성숙 생쥐의 정원줄기세포(spermatogonial stem cell, SSC)의 장기간 배양 중에 배아줄기세포와 유사한 특성을 가진 세포를 분리하였고, 이들을 배아줄기세포 배양환경에서 장기간 배양에 성공하였다. 이러한 줄기세포는 다분화능 정원줄기세포(multipotent spermatogonial stem cell, mSSC)로 명명되었고, 3배엽성 세포로의 체외분화와 기형종(teratoma) 형성, 키메라의 생산 성공을 통해 전분화능을 가진 것으로 확인되었다. 그리고 Guan 등(2006)과 Seandel 등(2007)은 성체생쥐의 정소 내에서도 이러한 다분화능 정원줄기세포의 분리와 증식의 성공을 보고한 바 있다.
- 줄기세포의 주입이 끝난 배아는 추가로 2일간의 배양을 통해 포배로 발생을 유도하였고, 이 과정에서 주입한 세포의 생존율을 높이기 위해 배아 배양액에 줄기세포의 배양액을 4% 추가하여 배양하였다. 주입된 줄기세포가 배아의 내세포괴에 재구축(reconstuction) 되었는지를 세포 주입 후 24시간째에 확인하였으며, 배아 이식 전 배반포기의 내세포괴에 형광이 발현되는 것을 확인하였다(Fig. 4A).
- 2). 형질전환된 다분화능 정원줄기세포는 GFP단백질의 발현을 보였으며, 전분화능 줄기세포의 마아커인 AP의 높은 activity와 높은 Nanog, Oct4 유전자의 발현을 관찰할 수 있었다. 또한 연구의 대조군으로 사용된 GFP-발현 생쥐의 배아줄기세포 역시 전분화능 세포의 마아커에 강한 발현을 보였다.
후속연구
- 따라서 실제로 생식계통으로 전이가 되는 형질전환동물의 생산을 위한 추가의 연구가 절실하다. 그리고 다분화능 정원 줄기세포는 이러한 장점 이외에도 신생 또는 성체의 정소로부터 회수가 가능하여 면역거부반응을 피할 수 있는 맞춤형 줄기세포로서의 장점도 가지고 있어 세포치료제 부분에서도 보다 많은 연구가 필요하다.
- 하지만 태어난 산자 중에 키메라의 생산효율은 배아줄기세포에 비해 별다른 차이가 없었다. 더욱이 본 연구에 사용된 배아가 BDF1 hybrid(DBA/2xC57BL/6) 생쥐로부터 회수되고, 대조군 공여자로 사용된 배아줄기세포의 strain 이 C57BL/6 strain인 점을 감안한다면 ICR strain의 전분화능 정원줄기세포를 공여자로 사용해서 산자의 생산이 낮아진 점은 충분히 설명이 가능하다(Table 1). 더군다나 산자의 생산이 저조함에도 불구하고 유전자가 변형된 키메라 생쥐의 생산효율의 차이가 없다는 점은 다분화능 정원줄기세포가 배아줄기세포에 비해 충분한 경쟁력을 가질 수 있다는 점을 증명하고 있다.
- Shinohara 등(2007)은 inbred strain인 DBA/2 strain으로 부터 다분화능 정원줄기세포주를 확립하였고, 이들을 이용하여 유전자변형생쥐의 생산에 성공한 바 있다. 따라서 이러한 inbred strain 다분화능 정원줄기세포를 확립하거나 분양 받아서 직접적으로 비교하는 추가의 연구가 필요하다.
- , 2008). 하지만 본 연구결과는 다분화능 정원줄기세포를 이용한 유전적 키메라의 생산기술이 outbred 생쥐에서 가능하였고, 이러한 기술이 유전자변형동물의 생산으로 발전한다면 그 효율이 낮은 가축과 대동물 시스템에도 적용이 가능할 것으로 여겨진다.
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