문제 정의

• 따라서 본 실험은 cortisol이 난소내 스테로이드 호르몬 합성과 세포자연사에 직접적으로 미치는 영향을 알아보기 위하여 배양된 사람의 과립-황체화 세포에 cortisol과 FSH를 처리한 후 생성되는 P₄와 E₂의 양을 측정하고, 배양된 과립-황체화 세포의 세포자연사 양상을 조사하였다.
• 따라서 본 연구에서는 배란전 난포에 고농도로 존재하는 cortisol이 과립-황체화 세포에 미칠 수 있은 영향을 알아보기 위하여, 과립-황체화 세포에 cortisol을 농도별로 처리하고 세포자연사와 분비되는 E₂와 P₄의 양을 조사하였다. 먼저 과립-황체화 세포에서 세포자연사를 확인한 결과, 처리된 cortisol 농도에 의존적으로 세포자연사가 증가하는 것을 알 수 있었고, 또한 이러한 cortisol에 의한

  제안 방법

  • )를 처리하였다. 24시간 배양 후 배양액을 수거하여 호르몬 양을 측정하고 부착된 세포에서 세포자연사를 조사하였다.
  • Louis, MO)가 들어있는 배양액으로 옮겨주었다. 37℃ 배양기에서 30분 경과 후 과립-황체화 세포들을 26G 주사 바늘을 이용하여 여러 번 흡입과 배출을 해줌으로써 뭉쳐져 있던 세포 덩어리를 낱개의 세포들로 분리시킨 다음 hemocytometer를 이용하여 세포수를 계산하였다. 생존율을 측정하기 위하여 trypan blue 용액(Sigma ChemicalCo.
  • Cortisol이 사람 과립-황체화 세포에 세포 죽음을 유발시킬 수 있는지를 알아보기 위하여 배양된 과립-황체화 세포에 cortisol을 처리하고 세포의 생존율을 조사하였다. 세포의 생존율은 배양 1일째 세포의 수를 100%로 하고 그것에 대한 상대적인 비율로 나타내었다.
  • 세척 후 FITC가 결합되어 있는 anti-digoxigenin antibody로 37℃에서 30분간 처리한 후 Tris buffer로 세척하고 propidium iodide로 2차 염색을 시행하였다. Fluorescence mounting 용액으로 봉입한 후 형광 현미경하에서 세포자연사가 일어난 세포를 조사하였다. 세포자연사 비율은 임의적으로 선택된 200배 시야에서 각각 다른 시야로 5번을 옮기면서 300～500개의 세포를 계수하였으며, 이와 같은 계수를 5번의 각각 다른 실험에서 반복하였다.
  • 각">3). 각 호르몬 측정시 검사간 정밀도와 검사내 정밀도는 상기한 3종의 관리 혈청을 이용하여 분석하였다. 각각의 난포에서 추출된 난포액은 배양 접시에 옮기고, 난포액 내에 존재하는 과립-황체화 세포들을 채취하였으며, 배양액에 옮긴 후 혈구세포들을 분리하기 위해 과립-황체화 세포가 들어있는 배양액 1 ㎖를 40% percoll 3 ㎖ 위에 조심스럽게 올려놓고 300×g에서 20분간 원심분리하였다.
  • 후)검사 내">검사내 정밀도는 농도별로 동일한 관리 혈청을 연속 측정하여 변이 계수를 구하였고, 검사간 측정값의 재현성과 시약의 안정성을 평가하기 위한 검사간 정밀도는 3종의 동일 관리 혈청과 동일한 측정 시약을 이용하여 측정한 후 변이 계수를 구하였다. 3가지 후)배 아이식">배아이식 시술을 시행하는 환자로부터 난자를 채취하는 과정에서 얻어 사용하였다. 난소의 과배란 유도는 FSH(Metrodin, MerckSerono, Germany)와 hMG(IVF-M, LG Chem. Co., Korea) 또는 GnRH 작용제(Buserelin acetate; Suprefact, United Kingdom)와 FSH/hMG를 병용하여 시행하였다. 난포의 성장은 , Korea) 또는 GnRH 작용제(Buserelin acetate; Suprefact, United Kingdom)와 FSH/hMG를 병용하여 시행하였다. 난포의 성장은 질식 초음파와 호르몬 측정으로 확인하였으며, 난포의 크기가 18㎜ 이상이거나 난포당 E₂ 수준이 300～400 pg/㎖ 이상인 경우 hCG(Pergonal, MerckSerono) 10,000 IU를 주사하여 배란을 유도하였고, 주사 후 35～36시간에 질식 초음파로 난포를 확인하면서 질벽을 통하여 난포액을 채취하였다.
  • 배양된 과립-황체화 세포에서 세포자연사를 확인하기 위하여 terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling(TUNEL) kit(ApopTag; Millipore, Billerica, MA)를 사용하였다. 배양된 세포는 4% neutral buffered formalin로 10분간 고정한 후 Tris buffer로 세척하였다.
  • 준비된 과립-황체화 세포를 24-well 배양접시에 옮겨서 48시간 배양한 후 배양접시 바닥에 세포들이 충분히 부착되어 있는 것을 확인하고 배양액을 갈아주었으며, 다시 24시간 배양 후 배양액을 갈아주면서 배양접시 바닥에 부착된 세포를 trypan blue로 염색하여 살아있는 세포를 계수하여 생존율을 계산하였다. 배양액 교환 후 실험군에는 각각 5, 50, 500 ㎍/㎖ cortisol(Sigma Chemical Co.)와 1 IU/㎖ FSH(Sigma Chemical Co.)를 처리하였다. 24시간 배양 후 배양액을 수거하여 호르몬 양을 측정하고 부착된 세포에서 세포자연사를 조사하였다.
  • 배양액은 Dulbecco's Modified Eagle Medium(dMEM; GIBCO, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)에 10% fetal bovine serum(FBS; GIBCO)과 2 mM L-glutamine(GIBCO), 100 U/㎖ penicillin(GIBCO), 100 ㎍ /㎖ streptomycin(GIBCO)을 첨가하여 사용하였다.
  • 여기에 35 ㎕의 8 M potassium acetate를 넣고 시료를 잘 섞은 후 60분간 단백질이 가라앉도록 얼음에 방치한 후 시료를 4℃, 5,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액은 1.5 ㎖ 미량원심분리 시험관으로 옮기고, 동량의 phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, V:V:V)를 첨가하여 DNA를 추출하였으며, 다시 동량의 chloroform:isoamyl alcohol(24:1, V:V)로 재추출하였다. 상층액을 1.
  • 후)과립-황체화세포들을">과립-황체화 세포들을 26G 주사 바늘을 이용하여 여러 번 흡입과 배출을 해줌으로써 뭉쳐져 있던 세포 덩어리를 낱개의 세포들로 분리시킨 다음 hemocytometer를 이용하여 세포수를 계산하였다. 생존율을 측정하기 위하여 trypan blue 용액(Sigma ChemicalCo.)을 사용하여 염색한 후 염색되지 않은 세포를 계수하여 생존율을 계산하였다. 배양에 사용한 세포는 생존율 70% 이상을 보이는 것으로 배양액 1 ㎖당 100,000개의 세포를 넣어 배양하였다.
  • 0)에 용해시킨 후 1 ㎕의 DNase-free RNase(500 ㎍/㎖; Boehringer-Mannheim, IN)을 첨가하고 60분 동안 37℃에서 방치하였다. 시료의 DNA를 동량의 phenol:chloroform: isoamyl alcohol로 추출 후, 동량의 chloroform:isoamyl alcohol로 재 추출하였다. 상층액을 모아서 0.
  • 이러한">1A). 이러한 생존율의 감소가 FSH에 의하여 억제될 수 있는지를 조사하기 위하여 cortisol 50 ㎍/㎖와 FSH 1 IU/㎖를 함께 처리한 후 세포의 생존율을 조사하였다. Cortisol 만을 처리한 군에서 5일째 생존율은 43.
  • 이러한 세포의 죽음이 세포자연사에 의한 것인지를 확인하기 위하여 배양된 세포에서 TUNEL 방법으로 세포자연사를 조사하였고, 또한 배양된 세포에서 추출된 DNA를 이용하여 분절화 정도를 분석하였다. FSH와 cortisol을 처리하고 3일째에 TUNEL 방법으로 apoptotic 세포들을 확인한 결과, 대조군 세포에서는 몇 개의 세포에서만 TUNEL 방법에 의해 염색된 것을 확인할 수 있었고, FSH만을 처리한 군에서는 염색된 apoptotic 세포를 거의 찾아볼 수 없었다.
  • 후)다음－20℃에">다음 －20℃에 보관하였다. 이렇게 추출된 DNA를 lane당 5 ㎍의 농도로 1.5% agarose gel에 loading하고, running buffer로는 TBE 용액을 사용하였으며, 50 V에서 3시간 동안 전기영동을 시행한 후 ethidium bromide로 염색하여 자외선 transilluminator로 확인하였다.
  • , Carlsbad, CA)에 10% fetal bovine serum(FBS; GIBCO)과 2 mM L-glutamine(GIBCO), 100 U/㎖ penicillin(GIBCO), 100 ㎍ /㎖ streptomycin(GIBCO)을 첨가하여 사용하였다. 준비된 과립-황체화 세포를 24-well 배양접시에 옮겨서 48시간 배양한 후 배양접시 바닥에 세포들이 충분히 부착되어 있는 것을 확인하고 배양액을 갈아주었으며, 다시 24시간 배양 후 배양액을 갈아주면서 배양접시 바닥에 부착된 세포를 trypan blue로 염색하여 살아있는 세포를 계수하여 생존율을 계산하였다. 배양액 교환 후 실험군에는 각각 5, 50, 500 ㎍/㎖ cortisol(Sigma Chemical Co.
  • 후)교환해주었고,">교환해 주었고, cortisol와 FSH를 농도별로 처리하였다. 처리 후 24시간에 배양액을 획득하여 P₄와 E₂를 측정하였다.
  • 후)화학발광 면역">화학발광면역 측정법(Chemiluminescence assay; CIA)으로 시행하였다. 획득된 세포는 2 동안 배양한 후 새 배양액으로 교환해 주었고, cortisol와 FSH를 농도별로 처리하였다. 처리 후 24시간에 배양액을 획득하여 P₄와 E₂를 측정하였다.

  대상 데이터

  • 후)사람과립-황체화">사람 과립-황체화 세포는 체외수정 및 배아이식 시술을 시행하는 환자로부터 난자를 채취하는 과정에서 얻어 사용하였다. 난소의

    데이터처리

    • 실험은 5번 반복하였으며, 스테로이드 농도와 세포자연사 비율은 모두 평균+표준오차로 표시하였다. 통계학적 정확도는">2). 정확도는 각 호르몬 농도를 확인한 고농도의 혈청을 희석하여 각 농도별로 5회씩 측정한 후 평균값을 구하여 계산하였다. 정확도는 E₂에서 각 검사간 상관관계가 Y=0.
    • 실험은 5번 반복하였으며, 스테로이드 농도와 세포자연사 비율은 모두 평균+표준오차로 표시하였다. 통계학적 유의성 검정은 one-way ANOVA, Tukey test 방법을 사용하였으며, 대조군과 실험군을 비교하여 p 값이 0.05보다 작은 경우를 유의하다고 판정하였다.

  이론/모형

  • Cortisol에 의해 일어난 세포자연사 정도를 정확히 분석하기 위해 TUNEL 방법으로 염색된 apoptotic 세포를 계수하였다. Cortisol 5 ㎍/㎖를 처리한 군에서 apoptotic 세포의 비율은 26±12.
  • 배양액 내 호르몬의 정량은 ACS:180^TM system (Ciba-Cornig, USA)을 이용한 화학발광면역 측정법(Chemiluminescence assay; CIA)으로 시행하였다. 획득된 세포는

    성능/효과

    • 후)변이계수를">변이 계수를 구하였다. 3가지 표준 검체를 사용하여 얻은 검사내 정밀도 및 검사간 정밀도는 각각의 변이 계수가 대부분 10% 이하로 나타났으나, 저농도 표준 검체의 정밀도는 10%를 조금 상회하였다(Table 4).
    • 3일간 배양한 과립-황체화 세포에 5, 50, 500 ㎍/㎖의 cortisol 과 1 IU/㎖ FSH를 처리한 후 배양액내 P4와 E2의 양을 측정한 결과, P4의 농도는 FSH만을 처리한 군에서 31±7.1 ng/㎖ 로 대조군 13±4.2 ng/㎖에 비해 3배 정도의 증가를 보였다.
    • Cortisol 5 ㎍/㎖를 처리한 군에서 apoptotic 세포의 비율은 26±12.7%로 cortisol을 처리하지 않은 대조군(13±18.7%)에 비하여 유의한 차이 없이 나타났으나, 50와 500 ㎍/㎖를 처리한 군에서는 각각 62±17.7%와 60±10.5%로 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(Fig. 3A).
    • 이러한 생존율의 감소가 FSH에 의하여 억제될 수 있는지를 조사하기 위하여 cortisol 50 ㎍/㎖와 FSH 1 IU/㎖를 함께 처리한 후 세포의 생존율을 조사하였다. Cortisol 만을 처리한 군에서 5일째 생존율은 43.5%를 보였으며, cortisol과 FSH를 함께 처리한 실험군에서도 40.1%를 보여 cortisol에 의한 세포의 죽음은 FSH에 의해 회복되지 못한다는 것을 알 수 있었다(Fig. 1B).
    • 세포의 생존율은 배양 1일째 세포의 수를 100%로 하고 그것에 대한 상대적인 비율로 나타내었다. Cortisol 처리 후 2일 동안은 모든 실험군 간에 생존율이 80% 내외로 큰 차이를 보이지 않은 반면, 3일째부터는 50과 500 ㎍/㎖ cortisol을 처리한 군에서 생존율이 감소하는 경향을 보이다가 4일째와 5일째에는 생존율이 60% 이하로 통계학적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 1A). 이러한 생존율의 감소가 FSH에 의하여 억제될 수 있는지를 조사하기 위하여 cortisol 50 ㎍/㎖와 FSH 1 IU/㎖를 함께 처리한 후 세포의 생존율을 조사하였다.
    • 2A). DNA 분절화 분석 결과에서도 cortisol만을 처리한 군과, cortisol과 FSH를 함께 처리한 군 모두에서 DNA 분절화 정도가 많이 일어나는 것을 알 수 있었다(Fig. 2B).
    • FSH가 cortisol에 의해 유발된 세포자연사를 억제할 수 있는지를 알아보기 위하여 위와 동일한 방법으로 FSH 1 IU/㎖와 cortisol 50 ㎍/㎖를 함께 처리한 결과, apoptotic 세포의 비율은 FSH만은 처리한 군에서 2% 이하로 세포자연사가 완전히 억제된 반면, cortisol을 처리한 군에서는 60±19.6%를 보여 유의하게 증가된 것을 알 수 있었다.
    • 이러한 세포의 죽음이 세포자연사에 의한 것인지를 확인하기 위하여 배양된 세포에서 TUNEL 방법으로 세포자연사를 조사하였고, 또한 배양된 세포에서 추출된 DNA를 이용하여 분절화 정도를 분석하였다. FSH와 cortisol을 처리하고 3일째에 TUNEL 방법으로 apoptotic 세포들을 확인한 결과, 대조군 세포에서는 몇 개의 세포에서만 TUNEL 방법에 의해 염색된 것을 확인할 수 있었고, FSH만을 처리한 군에서는 염색된 apoptotic 세포를 거의 찾아볼 수 없었다. 반면 cortisol 만을 처리한 실험군과 FSH를 함께 처리한 실험군 모두에서는 전체 세포의 50% 이상에서 염색된 것을 확인할 수 , 2004). 따라서 본 실험에서도 과립-황체화 세포의 세포자연사가 P₄량의 감소에 의해서 유발됐는지를 알아보기 위하여 배양한 과립-황체화 세포에 cortisol을 처리하고 P₄의 양을 측정한 결과, P₄의 양은 cortisol 농도가 증가할수록 감소하였다. 이러한 결과는 사람 후)과립-황체화세포에">과립-황체화 세포에 직접적으로 작용하여 세포자연사를 유발시킬 수 있으며, 이로 인하여 난포 발달에 이상을 초래할 수 있음을 의미한다. 또한 본 실험 결과에서 cortisol의 세포자연사 효과를 FSH가 억제시키지 못함을 알 수 있었는데, 이러한 결과는 부신피질 기능에 이상이 생기거나 과다한 스트레스로 인한 혈청내 cortisol량이 증가할 경우 난소 폐쇄를 유발시킬 수 있으며, 아울러 여러 원인으로 혈중 cortisol 농도가 높은 환자인 경우 과배란 유도시 다량의 FSH 투여만으로 양질의 난자를 얻기 힘들 것으로 판단된다.
    • 후)과립-황체화세포에">과립-황체화 세포에 cortisol을 농도별로 처리하고 세포자연사와 분비되는 E₂와 P₄의 양을 조사하였다. 먼저 과립-황체화 세포에서 세포자연사를 확인한 결과, 처리된 cortisol 농도에 의존적으로 세포자연사가 증가하는 것을 알 수 있었고, 또한 이러한 cortisol에 의한 과립-황체화 세포의 죽음이 FSH에 의해 회복되지 못한다는 것도 알 수 있었다.
    • 반면, cortisol을 함께 처리하면 농도 의존적으로 P4의 양이 감소하였고, 50과 500 ㎍/㎖를 처리한 실험군에서 P4의 농도는 각각 16±5.1과 5±2.5 ng/㎖로 FSH만을 처리한 군에 비교하여 유의하게 감소하였다(Fig. 4A).
    • 본 실험에서 cortisol에 의한 과립-황체화 세포의 죽음이 면역세포에서와 같이 세포자연사에 의해 진행된다는 것을 확인할 수 있었다. 이런 결과는 cortisol가 본">2003). 본 연구에서도 난자 채취 과정에서 획득한 난포액에서 cortisol 농도를 측정한 결과, 100 ㎍/㎖ 내외의 높은 농도로 존재하고 있는 것을 확인할 수 있었다(Table 1). 비록 아울러 본 실험 결과에서 P₄ 합성의 감소는 FSH 처리에 의해 어느 정도 회복되었으나, 고농도의 cortisol을 FSH와 함께 처리한 결과에서는 회복되지 못한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 기존의 보고와는 다른 것으로써, Ben-Rafael 이상의 결과는 일정 농도 이상의 cortisol은 과립-황체화세포의 세포자연사를 유발시킬 수 있으며, 또한 P₄의 합성을 억제시킴으로써 난포 폐쇄를 직접적으로 유발시킬 수 있음 보여준다. 또한 cortisol은 FSH와 상관없이 난포 내 과립세포의 세포자연사를 유발시킬 수 있으나 한편, FSH와 cortisol을 함께 처리한 군에서는 62±10.5%를 보여 cortisol에 의한 apoptotic 효과를 FSH가 억제시키지 못하는 것으로 나타났다(Fig. 3B).
    • 회수율은 측정 kit(018303A; Ciba-Corning, USA)에 포함되어 있는 고농도 관리 혈청을 1.0배, 0.8배, 0.6배, 0.4배, 0.2배로 희석하여 계산하였으며, 3회 반복하여 평균값을 구한 결과 E₂는 83%, P₄는 85%로 나타났으며, 변이 계수는 전체적으로 10% 내외를 보였다(Table 2). 감도는 각 호르몬의 저농도

      후속연구

      • 후)난포액 내">난포액내 높은 농도의 P₄가 cortisol과 경쟁적으로 작용함으로써 그 효과는 억제될 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 본 연구 결과들은 기존의 연구 결과와 차이를 보이고 있으며, 앞으로 사람 과립-황체화 세포에 대한 cortisol의 생리적인 관련성을 밝혀 그 기전을 명확히 할 필요성이 있다.
      • ">있음 보여준다. 또한 cortisol은 FSH와 상관없이 난포 내 과립세포의 세포자연사를 유발시킬 수 있으나 난포액내 높은 농도의 P₄가 cortisol과 경쟁적으로 작용함으로써 그 효과는 억제될 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 본 연구 결과들은 기존의 연구 결과와 차이를 보이고 있으며, 앞으로 사람 과립-황체화 세포에 대한 cortisol의 생리적인 관련성을 밝혀 그 기전을 명확히 할 필요성이 있다.