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문제 정의
- 본 연구에서는 국내산 백련잎을 이용한 눈꽃 동충하초 균사체를 배양하여 기호성과 품질특성이 증진된 백련잎 발효차를 개발하고자, 그 열수 추출물과 에탄올 추출물에 대한 유리당, 유기산, 유리아미노산, 미네랄 성분 등을 분석하였고, 백련잎 발효차의 휘발성 성분 변화에 대하여 조사하였다.
제안 방법
- 대량 배양에 이용할 종균 배양물은 유리발효관(15×15×5 cm)에 백련잎 분말과 동일한 양의 가수를 하여 잘 혼합한 후, 121℃, 20분간 살균하여 동충하초 균사체가 자란 PDA 배지의 블록(8 mm)을 20개씩을 무균적으로 접종하여 제조하였다.
- 백련잎차 추출물 0.5 g을 증류수로 현탁시켜 10 mL로 정용한 다음, sulfosalicylic acid 25 mg을 첨가하여 4℃에서4시간 동안 방치시킨 후, 8,000 rpm에서 10분간 원심분리(Supra 22K, HANIL Co.)하여 단백질을 제거하여 얻은 상징액 중 일부를 0.22 μm membrane filter와 Sep-pak C18 cartridge에 차례로 통과시킨 후, 아미노산자동분석기(S433, Sykam Co., Eresing, Germany)를 사용하여 다음과 같은 조건으로 분석하였다.
- 백련잎차 추출물 0.5 g을 증류수로 현탁시켜 10 mL로 정용한 후, 8,000 rpm에서 10분간 원심분리(Supra 22K, HANIL Co.)하여 얻은 상징액 중 일부를 0.45 μm membrane filter와 Sep-pak C18 cartridge에 차례로 통과시킨 후 여액 20 μL를 HPLC(Spectra Physics 4000)로 분석하였다.
- 백련잎차 추출물 0.5 g을 증류수로 현탁시켜 10 mL로 정용한 후, 8,000 rpm에서 10분간 원심분리(Supra 22K, HANIL Co.)하여 얻은 상징액 중 일부를 0.45 μm membrane filter와 Sep-pak C18 cartridge에 차례로 통과시킨 후 여액 20 μL를 HPLC(Spectra Physics 4000, Irvine, USA)로 분석하였다.
- 본 실험에서 사용한 연잎은 (재)남도전통문화진흥원 남도차연구소에서 재배한 백련잎을 사용하였으며, 청정한 연잎을 수세ㆍ탈수시켜 자른(2×3 cm) 후, 덖음(180～210℃)과 유념(5～10분)공정을 3단계별로 전처리하였다. 연잎분말을 이용하여 제조한 동충하초 균사체의 종균 배양물을 전처리 연잎에 1%(w/w) 농도로 접종시켜 25℃에서 7일간 광선이 차단된 통기성 고체배양을 실시하였다. 최종적으로 발효 백련잎을 건조(40℃, 30～50분) 및 가향(80℃, 10～20분)공정을 통한 최종 수분함량을 5～7% 정도로 조절하였다.
- 눈꽃 동충하초를 이용한 발효 및 비발효 백련잎차 65 g에 중량비로 10배의 열수(85℃) 및 에탄올(60℃)을 가하여 각각 온도로 유지하면서 4시간씩 환류냉각으로 2회 추출한 후 여과지(No. 2, Advantec, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였으며, 다시 회전감압농축기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)에서 농축한 다음 그 농축물을 동결건조한 후 포장하여 -20℃에 보관하면서 시료로 사용하였다. 연잎차의 용매별 추출수율은 상기의 조건으로 농축한 후 중량법으로 측정하였으며, 갈변도는 추출물 0.
- 1 g에 진한 질산 10 mL를 가하여 처음에는 낮은 온도로 가열하고 점차 고온으로 가열하면서 분해하였다. 분해액이 백색 투명하게 되면 냉각시키고 분해액에 증류수를 가하고 100 mL로 정용 후 여과하여 여액을 분석시료로 하였다. 각 무기성분의 정량은 유도결합플라스마 분광광도기(ICP, Inductively Coupled Plasma, 3300DV, PerkinElmer Optima, Shelton, USA)를 이용하여 분석하였으며,분석조건으로 가스유속은 plasma 15 L/min, auxiliary 0.
- 분해액이 백색 투명하게 되면 냉각시키고 분해액에 증류수를 가하고 100 mL로 정용 후 여과하여 여액을 분석시료로 하였다. 각 무기성분의 정량은 유도결합플라스마 분광광도기(ICP, Inductively Coupled Plasma, 3300DV, PerkinElmer Optima, Shelton, USA)를 이용하여 분석하였으며,분석조건으로 가스유속은 plasma 15 L/min, auxiliary 0.5 L/min, nebulzer 0.8 L/min이었으며, RF power 1,300 watts, 유속 1.0 mL/min, sample flush time 30 sec, sample flush rate 4.0 mL/min, delay time 30 sec로 분석하였다(27).
- 눈꽃 동충하초 균사체를 이용한 백련잎 발효차와 비발효차의 열수와 에탄올 추출물에 대한 품질특성을 평가하기 위하여, 추출수율, 갈변도, 유리당, 유기산, 유리아미노산, 무기질의 함량을 조사하였고, 또한 수증기 증류법으로 백련잎차의 휘발성 성분을 동정하였다. 추출수율은 발효 및 비발효차 모두 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 높았으며, 백련잎 발효차의 열수 추출용매에서 유의적으로 가장 높은 26.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 연잎은 (재)남도전통문화진흥원 남도차연구소에서 재배한 백련잎을 사용하였으며, 청정한 연잎을 수세ㆍ탈수시켜 자른(2×3 cm) 후, 덖음(180～210℃)과 유념(5～10분)공정을 3단계별로 전처리하였다.
- 눈꽃 동충하초 균사체(Phaecilomyces japonica KOFRI 012)는 한국전통발효식품연구소에서 분양받아 potato dextrose agar(PDA, Difco, Detroit, USA) 배지에서 계대배양한 후에 사용하였다. 대량 배양에 이용할 종균 배양물은 유리발효관(15×15×5 cm)에 백련잎 분말과 동일한 양의 가수를 하여 잘 혼합한 후, 121℃, 20분간 살균하여 동충하초 균사체가 자란 PDA 배지의 블록(8 mm)을 20개씩을 무균적으로 접종하여 제조하였다.
- Mass spectrometry의 ion source 온도는 200℃, interface 온도는 260℃로 하고, EI+ mode에 ion energy는 70eV이었으며, 향기성분 확인 및 정량 실험은 TRIO-1 Lab. base data system과 NIST/NBS library를 이용하였다(29).
데이터처리
- 각 시료간의 유의성 검정은 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicage, IL, USA) software package를 사용하여 ANOVA 분산분석과 Duncan's multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준의 유의성 검정을 실시하였다(30).
이론/모형
- 눈꽃 동충하초를 배양하여 발효시킨 백련잎차의 향기성분은 수증기증류법으로 분석하였다. 즉, 휘발성 성분의 포집은 시료 100 g를 수기에 넣고 증류수를 가한 후 수증기증류를 하여 그 유액에 diethyl ether를 넣어 잘 교반하고 분획이 확실하게 되도록 하루 동안 냉장고에 방치하였다.
성능/효과
- 특히 유리당 중에는 glucose 함량이 눈꽃 동충하초 균사체 발효에 의해 열수 및 에탄올 추출물에서 각각 5.6배, 3.7배 유의적으로 증가되었으며(p<0.05), 다음으로는 sucrose로서 각각 1.8배, 2.2배 유의적으로 증가되었다(p<0.05).
- 그 결과 주요 유리당으로는 glucose>sucrose>fructose 순으로 검출되었고, 총 유리당은 발효 백련잎차의 열수 추출물에서 건물기준으로 43.4%로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 일반 백련잎차의 에탄올 추출물이 가장 낮은 6.4%를 나타내었다.
- 1과 같다. 백련잎차의 수율은 발효차의 열수 추출물은 에탄올 추출물보다 고형분 함량이 11% 정도가 높았으며, 비발효차는 7%정도 오히려 낮았는데, 그 중에서는 발효 백련잎차의 열수 추출용매에서 가장 높은 26.6%를 나타내었다. 그 다음으로는 비발효 백련잎 차의 에탄올 용매 추출물의 수율이 23.
- 5%로 높았다. 독특한 향과 맛을 부여하는 눈꽃 동충하초 균사체를 이용한 백련잎의 고상발효 과정은 그 열수 추출물의 수득율에서 약 1.6배 증가시켰으며, 발효과정에 의한 용매별의 추출수율은 상반되는 경향을 나타내었다.
- 2와 같다. 그 결과 백련잎차의 갈변도는 흡광도로서 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비하여 1.6배 이상의 상당히 높은 값을 나타내었으며, 특히 발효 백련잎차의 열수 추출물은 흡광도 2.09로서 에탄올 추출물의 0.37보다 5.7배 이상 차이를 나타내었다. 이는 백련잎의 발효과정을 통한 효소적 가수분해와 그에 따른 열수 추출 및 갈색화 반응의 촉진에 의한 것으로 판단된다(1,2).
- 특히 발효과정으로 통하여 전체적으로 유기산 함량이 증가되었으며, 그 중에서 succinic acid의 함량은 에탄올 추출물에서 유의적으로 가장 높게 나타났고(p<0.05), 또한 열수 및 에탄올 추출물에서 각각 1.9배, 1.3배의 증가를 나타내었다(p<0.05).
- 한편, 발효 백련잎차는 비발효차에 비하여 총 유리아미노산 함량이 감소하는 경향이었으며, 용매별로는 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비하여 2.9배 유의적으로 높았고(p glutamic acid> threonine> arginine> serine> arginine 등으로 각각 70 mg% 이상을 차지하였다.
- 다음으로는 histidine이 각각 353.5 mg%와 269.5 mg%로 나타났으며, 대부분의 유리아미노산은 glycine, alanine, cystine 및 isoleucine을 제외하고는 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비하여 유의적으로 높게 나타나는 경향이었다(p<0.05).
- 백련잎차의 각 추출물 중의 총 유리아미노산 함량은 대체로 건물당 346.4～1,480.8 mg% 범위로서, 유리당과 유기산의 경우와는 달리 비발효 백련잎차의 열수 추출물이 가장 높은 함량을 나타내었으며, 발효 백련잎차의 에탄올 추출물에서 가장 낮은 것으로 나타났다(p<0.05).
- 05). 이상의 결과는 본 연구에서 사용한 눈꽃 동충하초 균사체의 탄수화물 가수분해효소 활성에 기인되는 것으로 판단되며(31), 백련잎차의 향이나 맛에 좋은 효과를 줄 것으로 예측된다(2).
- 눈꽃 동충하초의 균사체를 이용한 백련잎차의 각 추출물에 대한 유기산 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 백련잎차의 각 추출물 중의 총 유기산 함량은 대체로 건물당 861.9～4,704.8 mg% 범위로서 발효 백련잎차의 에탄올 추출물이 가장 높은 함량을 나타내었으며, 비발효 백련잎차의 열수 추출물이 가장 낮은 것으로 나타났다. 그리고 눈꽃 동충하초 균사체의 백련잎 발효차는 비발효차의 경우와는 달리 acetic acid, malic acid, tartaric acid가 95.
- 8 mg% 범위로서 발효 백련잎차의 에탄올 추출물이 가장 높은 함량을 나타내었으며, 비발효 백련잎차의 열수 추출물이 가장 낮은 것으로 나타났다. 그리고 눈꽃 동충하초 균사체의 백련잎 발효차는 비발효차의 경우와는 달리 acetic acid, malic acid, tartaric acid가 95.7～633.4 mg% 함량으로 검출되었지만, 비발효차의 열수 추출물에 존재하는 glutaric acid는 분석되지 않았다. 특히 발효과정으로 통하여 전체적으로 유기산 함량이 증가되었으며, 그 중에서 succinic acid의 함량은 에탄올 추출물에서 유의적으로 가장 높게 나타났고(p<0.
- 05). 이상의 결과에서 백련잎 발효차의 주요 유기산은 대체로 대사과정의 구연산회로에서 나타나는 약산으로서 발효차의 기호성을 증진시키는데 기여할 것으로 예측된다(2,25).
- 05). 주요한 유리아미노산으로는 발효 및 추출용매에 따라 총 15～17개가 분석되었는데, 비발효 백련잎차의 경우는 glutamic acid가 가장 높은 함량을 나타내었으며, 열수 및 에탄올 추출물에서 각각 389.2 mg%와 173.5 mg%였다. 다음으로는 histidine이 각각 353.
- 05), 비교적 높은 유리아미노산은 lysine> glutamic acid> threonine> arginine> serine> arginine 등으로 각각 70 mg% 이상을 차지하였다. 또한 발효 백련잎차에서 비발효차에 나타나지 않은 methionine이 열수 및 에탄올 추출물에서 미량으로 검출되었고, 열수 추출물에서는 검출되지 않은 proline이 37.2 mg%가 나타났다.
- 그리고 열수 및 에탄올 추출물의 총 무기질 함량은 대체로 건물 당 445.0～1,095.7 mg%로서 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비하여 각각 2.1배, 1.7배 높은 함량을 나타내었으며, 그 중에서는 백련잎 발효차의 열수 추출물이 유의적으로 가장 높은 함량을 나타내었다(p<0.05).
- 특히 무기물 중에는 K가 407.9～825.4 mg% 범위로 가장 높은 함량이었는데, 열수 및 에탄올 추출물은 전체 무기질에 비하여 각각 비발효차는 80.8%와 92.3%, 발효차는 75.6%, 91.4%를 차지하였다(p<0.05).
- 눈꽃 동충하초의 균사체를 이용한 백련잎차의 각 추출물에 대한 휘발성 성분을 측정한 결과는 Table 5와 같다. 백련잎차의 총 휘발성 성분은 비발효차 및 발효차에 대해 각각 90개, 106개로 나타났지만, 그 중에 aldehyde류 11종, alcohol류 14종, ketone류 11종, hydrocarbone류 11종, acid류 12종으로 총 59개를 동정할 수가 있었다. 그리고 비발효 백련잎차의 주요 휘발성분으로는 curcumene 14.
- 백련잎차의 총 휘발성 성분은 비발효차 및 발효차에 대해 각각 90개, 106개로 나타났지만, 그 중에 aldehyde류 11종, alcohol류 14종, ketone류 11종, hydrocarbone류 11종, acid류 12종으로 총 59개를 동정할 수가 있었다. 그리고 비발효 백련잎차의 주요 휘발성분으로는 curcumene 14.42%, 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-phenol 11.95%, cyclohexen 4.67%, phenethyl alcohol 2.88%, nonanoic acid 2.41%, 2,3-dihydro-benzofuran 2.24%, benzaldehyde 2.17%, hexanoic acid 1.63% 등이 순차적으로 상대적인 면적 비율이 높았으며, 전체적인 휘발성분 중에서 비발효차는 발효차에 비하여 alcohol류가 상대적으로 종류나 면적 비율이 높은 경향이었다. 그러나 눈꽃 동충하초 균사체로 배양한 백련잎 발효차는 비발효차의 높은 비율인 상기의 curcumene～nonanoic acid보다는 대체적으로 낮은 수치를 나타내었지만, 그 외의 휘발성 성분에서는 발효차의 경우가 상대적으로 조금씩 높게 나타났다.
- 그러나 눈꽃 동충하초 균사체로 배양한 백련잎 발효차는 비발효차의 높은 비율인 상기의 curcumene～nonanoic acid보다는 대체적으로 낮은 수치를 나타내었지만, 그 외의 휘발성 성분에서는 발효차의 경우가 상대적으로 조금씩 높게 나타났다. 또한 백련잎 발효차는 furfural을 포함한 aldehyde류 및 2(3H)-furanone을 포함한 ketone류에서 비발효차보다 상대적으로 다양한 성분들이 확인되었다. 그리고 수증기 증류법을 통한 전체적인 휘발 성분의 패턴을 보면, 백련잎 발효차에서 미확인된 휘발성 성분이 많았으며, 비발효차에 비하여 상대적으로 분석 초기에 나타나는 저분자 휘발성 성분의 종류가 많았고, 면적 비율도 높은 편이었다.
- 또한 백련잎 발효차는 furfural을 포함한 aldehyde류 및 2(3H)-furanone을 포함한 ketone류에서 비발효차보다 상대적으로 다양한 성분들이 확인되었다. 그리고 수증기 증류법을 통한 전체적인 휘발 성분의 패턴을 보면, 백련잎 발효차에서 미확인된 휘발성 성분이 많았으며, 비발효차에 비하여 상대적으로 분석 초기에 나타나는 저분자 휘발성 성분의 종류가 많았고, 면적 비율도 높은 편이었다. 특히 백련잎 차의 주요 휘발성 성분인 curcumene은 1-(1,5-dimethyl4-hexenyl)-4-methyl-bezene로서 울금 향에 많이 존재하는 주요 성분중의 하나로 비발효차는 14.
- 추출수율은 발효 및 비발효차 모두 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 높았으며, 백련잎 발효차의 열수 추출용매에서 유의적으로 가장 높은 26.55%를 나타내었고(p<0.05), 갈변도는 흡광도로서 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비하여 1.6배 이상으로 높은 값을 나타내었다.
- 총 무기질은 비발효 및 발효차의 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비하여 각각 2.1배, 1.7배 높았으며, 그 중에서는 발효차의 열수 추출물이 유의적으로 가장 높은 함량을 나타내었다(p<0.05).
- 백련잎 발효차는 비발효차에 비하여 총 유리아미노산 함량이 감소하는 경향이었으며, 용매별로는 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비하여 2.9배 유의적으로 높았고(p<0.05).
- 총 유리아미노산은 건물 당 346.4～1,480.8 mg% 범위로서, 비발효 백련잎차의 열수 추출물이 가장 높은 함량을 나타내었다(p<0.05).
- 총 유기산은 861.9～4,704.8 mg% 범위로서 발효 백련잎차의 에탄올 추출물이 가장 높았으며, 그 중에는 succinic acid가 에탄올 추출물에서 유의적으로 가장 높았고(p<0.05), 백련잎 발효차는 비발효차의 경우와는 달리 acetic acid, malic acid, tartaric acid가 확인되었다.
- 총 유리당은 백련잎 발효차의 열수 추출물에서 43.4%로 가장 높은 함량을 나타내었으며, glucose 함량은 발효차의 열수 및 에탄올 추출물에서 각각 5.6배, 3.7배 유의적으로 증가되었다(p<0.05).
- 05). 휘발성 성분은 aldehyde류 11종, alcohol류 14종, ketone류 11종, hydrocarbone류 11종, acid류 12종으로 총 59개를 동정할 수가 있었으며, 특히 비발효차는 alcohol류, 발효차는 aldehyde류와 ketone류에서 서로 다른 휘발성분들이 확인되었다.
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