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문제 정의
- 본 연구에서 조사된 유전자 중 마이크로어레이와 정량적 역전사 중합 효소 반응에서 동일한 결과를 보이면서 유의하게 변화된 INHA을 설명하고자 한다. 인히빈은 Bcl-2, Bax, FSH, FASLG 및 caspases 등과 함께 난포를 선택하는 분자로 구분되며(Elvin 등, 1999; Hussein, 2005) 난포기 전반에 걸쳐발현한다.
- 본 연구에서는 난소낭종이 세포사멸과 어떠한 관련성이 있는지를 조사하고자 정상 난소, 난포낭종 및 황체낭종에서 유전자 수준 및 단백 수준에서 세포사멸 관련 유전자의 발현 변화를 확인하였다. 본 실험 조건에서는 정상에 비해 난포낭종및 황체낭종에서 유의한 세포사멸 현상이 확인되지 않았으며, 이러한 결과는 세포생존과 관련된 인자들과 세포사멸 관련 유전자의 발현 감소로 초래된 것이라 유추된다.
- 본 연구의 문제점 중 하나는 도축장으로부터 회수된 난소를 실험 재료로 사용하다보니 정확한 발정 주기의 확인이 되지 않은 난소를 실험에 사용하는 점이다. 이러한 문제점을 보충하기 위하여 면역 염색 또는 각 난포의 액으로부터 호르몬을 정량하여 비교하긴 하지만 충분한 해결은 이루어지지 않을 것 같다.
제안 방법
- Fig. 3에서 보여지는 바와 같이 세포자멸의 분자적 기전을밝히기 위하여 난포낭종과 황체 낭종에서 mitogen-activated protein kinase(MAPK)의 활성 정도를 웨스턴 블랏 분석을 통해확인하였다.
- 과립층세포의 사멸에 따라 형성될 수 있는 난포낭종 및 황체낭종의 세포자멸사를 마이크로어레이(microarray, chip) 방법을 이용하여 2배 이상 변화되는 세포사멸 관련 유전자를 근거로 정상난소와 비교분석하였다.
- 난포낭종과 황체낭종의 세포 자멸에 있어서 caspase의 활성 역시 이루어지지 않았다. 미토콘드리아의 세포사멸 관련 단백질의 변화를 살펴보기 위해 대표적인 세포자멸 유발인자인 Bax의 저해 인자로 알려진 Bel- 2 와 Bcl-xL을 단백질 분석을 통해 확인하였다. Bax, Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현은 정상에 비하여 난소낭종에서 두드러진 변화를 보이지 않았다("=3).
- 2 ml PCR tube에 넣고 94℃에서 35분간 반응을 유도하였다. 분절된 cRNA는 GeneChip Bovine Genome Array Chips(Affymetrix)을 이용하여 제조사의 실험 과정에 따라 진행하였다. 어레이(array)들은 streptavidinphycoerythrin complex# 가지고 염색한 후 GeneChip Operating Software(Affymetrix, CA, USA)로 강도를 조정하여 GeneChip scanner 3000(Affj/metrix)을 이용하여 스캔하고 발현 패턴을 분석하였다.
- 세포사멸을 확인하기 위하여 in situ cell death detection kit (Roche, Mannheim, Germany) 를 이용하여 Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling(TUNEL) 염색을 실시하였다. 4% paraformaldehyde로 고정된 세포를 PBS 로 세척한 후 세포에 TUNEL reaction mixture의 침투를 용이하게 하기 위해 permeabilization 용액을 30분간 처리하고 15 분간 PBS로 3회 세척하였다.
-
3. 세포사멸
세포자멸사 확인을 위하여 TUNEL 형광염색을 실시하였다. 자멸사가 일어난 세포는 DNA 절편화가 일어난 부위에fluorescein isothiocyanate(FITC) 형광염색제가 염색되어 난포낭종과 황체낭종의 일부 세포가 초록색으로 나타났다(m=4,Fig.
- 분절된 cRNA는 GeneChip Bovine Genome Array Chips(Affymetrix)을 이용하여 제조사의 실험 과정에 따라 진행하였다. 어레이(array)들은 streptavidinphycoerythrin complex# 가지고 염색한 후 GeneChip Operating Software(Affymetrix, CA, USA)로 강도를 조정하여 GeneChip scanner 3000(Affj/metrix)을 이용하여 스캔하고 발현 패턴을 분석하였다. 마이크로어레이 분석의 전 과정은 서린 바이 오(an agency of Affymetrix Gene Chip, Seoul, South Korea)에 의뢰하였다.
- 이때 양성대조군(positive control)은 DNase 를 37℃에서 1시간 동안 처리한 후 TUNEL reaction mixture 로 반응 시키고, 음성대 조군(negative control)은 terminal trans- ferase를 제외한 TUNEL reaction mixture로 반응시켰다. 이 후 PBS로 15분간 3회 세척한 후 세포를 wet mounting하여 형광현미경하에서 세포 사멸을 관찰하였다.
- 5 ml 튜브로 옮기고Bradford protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 시 약을이용하여 정량하였다. 정량된 단백질 중 50-100 g을 각 웰에 넣어 10% SDS-PAGE에서 전기영동한 후 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane(0.45 m, Millipore, Bedford, MA,USA)에 전기영동한 단백질을 옮긴 후, blocking 용액(5% fet- free milk and 0.05% Tween20 in TBS), 1차 항체(Anti-ERK, -pERK, -Jnk, -pJuk, -p38, -pp38, -Bcl-xL, -Bax, -Bcl-2, -Caspase-3, -PI3K, -Akt 및 -pAkt; Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA), 2차 항체 (Sigma, St Louis, MO, USA)를 처리하고 membrane을 세적한 후 암실에서 enhanced chemiluminescence (ECL Plus kitELPIS, Taejeon, Korea)을 이용하여 특정 단백 질을 증폭시켜 단백 존재를 확인하였다. 각 단백질의 발현량은 actin의 발현량으로 정량 .
- 정상에 비해 난포낭종 및 황체낭종 어레이에서 증가(up)/감소(down)하는 세포사멸 관련 유전자를 유전자 존재론(Gene ontology) 정보 분석을 통하여 정리하였다(www.go- database.org). 세포 사멸 관련 유전자 중 2배 이상 변화되는 유전자(differentially expressed genes; DEG)를 의미 있는 유전자로 간주하여(log 2=1) 보여주고 있다.
- 증폭산물은 염기서열 분석을 통하여 확인하였다. 각 유전자의 mRNA 발현량은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 발현량으로 정량 .
- 황체낭종에서 검출된 DEG 9개를 정량적 역전사 중합 효소 반응을 이용하여 mRNA 발현 변화를 검증하였다. 마이크로어레이 분석에서 증가하는 DEG 5개(TNF-RAF2, PRLR, FOXL2, STK4 및 COL4A3)와 감소하는 DEG 4개 (INHA, CIDEB, BCL10 및 FASLG)를 정량적 역전사 중합효소 반응으로 재확인한 결과, 증가하는 DEG 5개는 정량적 역전사 중합효소 반응에서는 모두 감소하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 이용된 한우의 난소는 도축장으로부터 회수되어 저온 상태에서(4℃) 실험실로 운반되었다. 난소는 세절 없이phosphate buffered saline(PBS)로 세척한 후 신속하게 2배 이상 부피의 RNer(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)에 담가 4℃에서 12시간 이상 보관하였다.
- Total RNA는 TRIzol(invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사"용하여 정상, 난포낭종 및 황체낭종을 보이는 난소로부터 추출되었다. 추출된 total RNA는 Superscript preamplification sys- tem(Invitrogen)과 oligo(dT)를 이용하여 cDNA로 합성되었다. 합성된 cDNA는 소(bovine)에 특징적으로 작용하는 primer를 이용하여 증폭되었다{Table 1).
데이터처리
- 실험 결과의 통계학적 분석은 Student's f-test를 이용하여 처리구간의 유의성을 검정하였고(p<0.05), 결과들은 평균 土 표준편차로 표시하였다.
이론/모형
- 3배 감소하였다. 황체낭종에서 변화되는 DEG를 난포낭종 검체에서도 정량적 역전사 중합효소 방법을 이용하여 확인하였다. 정상난소에 비해 난포낭종에서 PRLR2,STK4 및 BCL10은 증가하고 TRAF, FOXL2, COL4A3, INHA, CIDEB 및 FASLG는 감소하였다(#=3, p<0.
성능/효과
- 변화율에는 다소 차이를 보였다. INHA의 경우 마이크로 어레이 결과에서는 1.43배 감소하고 정량적 역전사 중합 효소 반응 결과에서는 12.3배 감소하였다. 황체낭종에서 변화되는 DEG를 난포낭종 검체에서도 정량적 역전사 중합효소 방법을 이용하여 확인하였다.
- 세포 사멸 관련 유전자 중 2배 이상 변화되는 유전자(differentially expressed genes; DEG)를 의미 있는 유전자로 간주하여(log 2=1) 보여주고 있다. 난포낭종에서는 전체 1, 852개 유전자 중 934개가 증가하고 918개가 감소하였으며, 증가하는 934개 유전자 중 세포사멸과 관련된 유전자는 5개(2개의 DEG를 포함해 서 cytocrome C, Apo-2 ligand 및 inhibit! alpha(INHA))였다. 두 개의 DEG는 phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit, polypeptide 2(p85 beta)(PIK3R2) 와 v-akt murine thymoma viral oncogene homology 1(AKT1) 이다(Ta-ble 2).
- 마이크로어레이 분석 결과, 난포낭종과 황체낭종 모두에서PI3K와 Akt/PKB 유전자의 증가가 확인되었다(Fig. 4).
- 이용하여 mRNA 발현 변화를 검증하였다. 마이크로어레이 분석에서 증가하는 DEG 5개(TNF-RAF2, PRLR, FOXL2, STK4 및 COL4A3)와 감소하는 DEG 4개 (INHA, CIDEB, BCL10 및 FASLG)를 정량적 역전사 중합효소 반응으로 재확인한 결과, 증가하는 DEG 5개는 정량적 역전사 중합효소 반응에서는 모두 감소하였다. 감소하는 DEG 4개는 마이크로 어레이와 정 량적 역전사 중합효소 반응 결과 모두 일치하였다(Fig.
- 확인하였다. 본 실험 조건에서는 정상에 비해 난포낭종및 황체낭종에서 유의한 세포사멸 현상이 확인되지 않았으며, 이러한 결과는 세포생존과 관련된 인자들과 세포사멸 관련 유전자의 발현 감소로 초래된 것이라 유추된다.
- 현재까지 황체낭종에 있어서 세포자멸사에 관한 보고는 없다. 본 연구에 제시된 TUNEL 염색과 웨스턴 블랏 분석에 의해 보여진 결과들은 세포생존과 관련된 신호 및 세포사멸과 관련된 신호들의 정확한 발현이 확인되지 않아 세포자멸사를 강하게 증명할 수는 없다.
- 본 연구에서는 이러한 부분이 배제되었다. 본 연구의 결과는 난소낭종과 세포자멸사를 충분히 설명할 수는 없지만 난소낭종 시 극적인 세포사멸현상은 나타나지 않는 것으로 보여지며 부분적으로 나타나는 세포사멸 현상은 세포 생존인자의 발현 및 활성의 감소로 나타나는 것이라 추정한다.
- 자멸사가 일어난 세포는 DNA 절편화가 일어난 부위에fluorescein isothiocyanate(FITC) 형광염색제가 염색되어 난포낭종과 황체낭종의 일부 세포가 초록색으로 나타났다(m=4,Fig. 2).
- 황체낭종에서 변화되는 DEG를 난포낭종 검체에서도 정량적 역전사 중합효소 방법을 이용하여 확인하였다. 정상난소에 비해 난포낭종에서 PRLR2,STK4 및 BCL10은 증가하고 TRAF, FOXL2, COL4A3, INHA, CIDEB 및 FASLG는 감소하였다(#=3, p<0.05, Fig. 1).
- 난포낭종에서는 감소 DEG는 확인되지 않았다. 황체낭종에서는 2, 7기개 유전자 중 1, 789개가 증가하고 982개가 감소하였는데, 1, 789개의 증가 유전자 중 세포 사멸 관련 유전자 14개가 확인되었으며, DEG 5개가 포함되어있다. 감소하는세포사멸관련유전자는 12개가 확인되었으며, DEG가 4개 포함되어 있다.
후속연구
- 인히빈은 난포의 발달에 관여하고 세포사멸을 유도하며 세포주기를 정지시키기도 한다. 본연구에서 조사된 세포자멸사 유도 유전자들, INHA, CIDEB, BCL10 및 FASLG의 발현 감소는 낭종에서의 세포자멸사 억제요인으로 작용할 수 있을 것 같다.
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