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문제 정의
- 7) 이상의 시험은 정식상태에서 황함유 아미노산의 대사를 부분적으로 평가 하여 얻어진 결과들이다. 따라서 본 연구에서는 절식상태의 랫트 간에서 황함유 아미노산의 대사변화를 대사체 정량과 대사과정에 관련된 효소들의 활성을 측정하여 평가함을 목표로 하였다. 본 연구에서는 methionine, SAM, SAH, cysteine, GSH와 taurine의 정량과 함께 MAT, CBS, BHMT, GCL과 CDO의 활성을 평가하였다.
- 따라서 본 연구에서는 절식상태의 랫트 간에서 황함유 아미노산의 대사변화를 대사체 정량과 대사과정에 관련된 효소들의 활성을 측정하여 평가함을 목표로 하였다. 본 연구에서는 methionine, SAM, SAH, cysteine, GSH와 taurine의 정량과 함께 MAT, CBS, BHMT, GCL과 CDO의 활성을 평가하였다.
가설 설정
- 혈액에서 homocysteine의 농도가 증가하는 hyperhomocysteinemia 환자는 CBS의 유전적인 결함 등에 의해 발생하며 혈액에서 homocysteine의 증가는 심혈관계질환을 유발하는 중요한 인자로 확인되었다.6) GSH는 산화적 손상에서 세포를 보호하며 cysteine의 수송체 또는 저장체로 기능한다.5) SAM은 methylation 반응에서 methyl group의 공여체로 작용하며 최근 간세포의 기능을 조절하는 것으로 보고되었다.
제안 방법
- 24 또는 48시간 동안의 절식이 간에서 황함유 아미노산 및 이들의 대사체 함량에 미치는 영향을 실험하였다(Table I). 간에서 GSH와 SAM의 농도는 24시간의 절식에 의해 정상대조군에 비해 각각 60%와 76%로 감소하였으며 절식시간을 48시간으로 증가하였을 경우 더 이상의 감소는 발생하지 않았다.
- SAM과 SAH는 위에서 언급한 바와 같이 UV 검출기와 C18 column을 장착한 HPLC를 사용하여 분리 정량하였으며 methionine 역시 위에 언급한 바와 같이 O-phthaldialdehyde을 이용하여 유도체화하고 역상 column과 fluorometric 검출기를 장착한 HPLC로 분리 정량하였다. Cystathionine과 cysteine sulfinic acid 역시 O-phthaldialdehyde을 이용하여 유도체화하고 역상 column과 fluorometric 검출기를 장착한 HPLC로 분리 정량하였다. Gamma-glutamylcysteine은 monobromobimane을 이용하여 유도체화하고 역상 column과 fluorometric 검출기를 장착한 HPLC로 분리 정량하였다.
- Cystathionine과 cysteine sulfinic acid 역시 O-phthaldialdehyde을 이용하여 유도체화하고 역상 column과 fluorometric 검출기를 장착한 HPLC로 분리 정량하였다. Gamma-glutamylcysteine은 monobromobimane을 이용하여 유도체화하고 역상 column과 fluorometric 검출기를 장착한 HPLC로 분리 정량하였다.
- MAT, CBS, BHMT, GCL과 CDO 활성의 평가를 위하여 약 4 g의 간을 절취하여 3배 부피의 homogenizing buffer(1 mM의 EDTA와 50 mM의 Tris-HCl을 포함하는 0.154 M KCl 용액, pH 7.4)에 가하고 테프론 페슬을 이용하여 분쇄하였다. 분쇄한 후 4℃, 10,000 g의 조건에서 high speed centrifuge(Model J2, Beckman Instruments Inc.
- MAT의 활성은 SAM과 SAH, CBS는 cystathoinine, BHMT는 methionine, GCL은 gamma-glutamylcysteine 그리고 CDO는 cysteine sulfinic acid의 생성량을 정량하여 측정하였다. SAM과 SAH는 위에서 언급한 바와 같이 UV 검출기와 C18 column을 장착한 HPLC를 사용하여 분리 정량하였으며 methionine 역시 위에 언급한 바와 같이 O-phthaldialdehyde을 이용하여 유도체화하고 역상 column과 fluorometric 검출기를 장착한 HPLC로 분리 정량하였다.
- Methionine과 taurine의 정량을 위해 O-phthaldialdehyde을 이용하여 유도체화하고 역상 column(3.5 µm Symmetry C18 column; Waters, Milford, MA, USA)과 fluorometric 검출기 (RF-10A fluorescence detector, Shimadze, Tokyo. Japan)를 장착한 HPLC를 사용하였다.
- MAT의 활성은 SAM과 SAH, CBS는 cystathoinine, BHMT는 methionine, GCL은 gamma-glutamylcysteine 그리고 CDO는 cysteine sulfinic acid의 생성량을 정량하여 측정하였다. SAM과 SAH는 위에서 언급한 바와 같이 UV 검출기와 C18 column을 장착한 HPLC를 사용하여 분리 정량하였으며 methionine 역시 위에 언급한 바와 같이 O-phthaldialdehyde을 이용하여 유도체화하고 역상 column과 fluorometric 검출기를 장착한 HPLC로 분리 정량하였다. Cystathionine과 cysteine sulfinic acid 역시 O-phthaldialdehyde을 이용하여 유도체화하고 역상 column과 fluorometric 검출기를 장착한 HPLC로 분리 정량하였다.
- 2 ml을 가하여 잘 섞은 후 상온에서 4분간 방치하였다. 반응액에 12 units/ml 농도의 GSH reductase를 가하고 잘 섞은 후 412 nm에서 약 2분간 흡광도의 변화를 측정하여 linear한 1분간의 기울기 변화를 구하고 검량선으로부터 GSH 의 농도를 계산하였다.
- 유황함유 아미노산 및 대사체 측정을 위하여 랫트를 ether로 마취를 시키고 복대동맥에서 전혈을 취하고 간을 절취하였다. 간을 ice-cold 1 M perchloric acid 또는 1.
- 황함유 아미노산 및 관련 대사체의 변화를 유발한 기전을 규명하기 위해 methionine의 transsulfuration 과정을 매개하는 효소의 활성을 측정하였다(Table II). Methionine 대사의 첫 단계를 촉매하여 SAM을 합성하는 MAT의 활성은 48시간 절식에 의해 유의적으로 증가하였다.
대상 데이터
- Japan)를 장착한 HPLC를 사용하였다. 0.1 M sodium acetic acid (pH=7.2)와 3%(v/v)의 tetrahydrofuran을 함유한 methanol을 이동상으로 사용하였으며 농도구배를 주기위해 2개의 pump(model LC-10AT, Shimadze, Tokyo, Japan)를 이용하였다.
- 15% KCl 용액에서 분쇄하였다. SAM, SAH, GSH와 cysteine은 perchloric acid를 처리하고 원심분리하여 얻은 상등액을 시료로 사용하였으며 methionine과 taurine은 1.15% KCl 조직분쇄액을 methanol로 재단백하고 원심분리하여 얻은 상등액을 시료로 사용하였다. 자세한 분석 방법은 이전 보고를 따랐다.
- 중앙 실험동물에서 몸무게가 200~220 g의 웅성 SpragueDawley 랫트를 구입하여 2주간 안정화시킨 후 실험에 사용하였다. 특별한 언급이 없는 한 실험동물은 자유롭게 사료와 물을 섭취하였다.
데이터처리
- Values with different letters (a, b, c) are significantly different one from another (one-way ANOVA followed by Newman-Keuls multiple range test, P<0.05).
- 모든 실험결과는 평균±표준오차로 표시하였다.
- 실험군 사이의 통계적 차이는 ANOVA 후 Newman-Keuls test로 검사하였다. 모든 실험결과는 평균±표준오차로 표시하였다.
이론/모형
- GSH의 함량은 GSH reductase를 이용한 enzyme recycling 방법을 사용하였다. Eppendorf tubes에 0.
성능/효과
- CDO의 활성은 cysteine의 농도에 의존적인 것으로 보고되었다.2) 즉, cysteine의 증가는 CDO의 활성을 증가시키며 결과적으로 세포에서 cysteine의 축적을 억제하고 황함유 아미노산의 최종 배설체인 taurine의 합성을 촉진한다. 본 연구에서 cysteine의 농도는 절식에 의하여 증가하였으며 증가폭은 절식시간에 의존적이었다.
- 1) Methionine은 transsulfuration 과정을 통하여 methionine의 황을 serine에 전달함으로써 cysteine으로 전환된다.2,3) Methionine은 methionine adenosyltransferase(MAT)에 의해 S-adenoylmethionine(SAM)으로 전환 되며 SAM은 methylation 반응의 methyl 공여체 또는 polyamine 합성의 전구체로 그리고 전체 황함유 아미노산 대사의 조절자로 기능한다.4) SAM의 methylation 반응 후 생성되는 S-adenosylhomocysteine(SAH)은 가수분해되어 homocysteine으로 전환된다.
- 2,3) Methionine은 methionine adenosyltransferase(MAT)에 의해 S-adenoylmethionine(SAM)으로 전환 되며 SAM은 methylation 반응의 methyl 공여체 또는 polyamine 합성의 전구체로 그리고 전체 황함유 아미노산 대사의 조절자로 기능한다.4) SAM의 methylation 반응 후 생성되는 S-adenosylhomocysteine(SAH)은 가수분해되어 homocysteine으로 전환된다. Homocysteine은 betaine을 methyl 공여체로 이용하는 betaine homocysteine methyltransferase(BHMT)와 methyltetrahydrofolate를 methyl 공여체로 이용하는 methionine synthase 에 의해 methionine으로 전환되거나 cystathionine beta-synthase (CBS)에 의해 cystathionine을 경유하여 cysteine으로 전환된다.
- 절식에 의해 간에서 GSH의 농도는 급격히 감소하나 GSH 합성에서 속도결정단계를 촉매하는 gamma-glutamylcysteine ligase(GCL)의 발현은 변화가 없는 것으로 보고되었다.5) SAM의 농도 역시 절식에 의해 감소하나 SAM을 합성하는 MAT의 활성과 발현은 오히려 절식에 의해 증가하였다.7) 이상의 시험은 정식상태에서 황함유 아미노산의 대사를 부분적으로 평가 하여 얻어진 결과들이다.
- 황함유 아미노산 및 관련 대사체의 변화를 유발한 기전을 규명하기 위해 methionine의 transsulfuration 과정을 매개하는 효소의 활성을 측정하였다(Table II). Methionine 대사의 첫 단계를 촉매하여 SAM을 합성하는 MAT의 활성은 48시간 절식에 의해 유의적으로 증가하였다. 이 결과는 절식에 의해 MAT의 mRNA, 단백질 및 활성이 증가하나 MAT의 생성물인 SAM의 농도는 감소한다는 Sakata 등의7) 결과와 일치한다.
- 24 또는 48시간 동안의 절식이 간에서 황함유 아미노산 및 이들의 대사체 함량에 미치는 영향을 실험하였다(Table I). 간에서 GSH와 SAM의 농도는 24시간의 절식에 의해 정상대조군에 비해 각각 60%와 76%로 감소하였으며 절식시간을 48시간으로 증가하였을 경우 더 이상의 감소는 발생하지 않았다. 반대로 SAM의 methylation 반응생성물인 SAH의 농도는 24시간 절식에 의해 24.
- 간에서 cysteine의 농도는 절식에 의해 유의적으로 증가하였으며 증가폭은 절식시간에 의존적이었다(Table I). 또한 cysteine의 비가역적인 대사체인 taurine의 농도 역시 48시간 절식에 의해 약 207%로 현격히 증가하였다.
- 8 nmol/g liver로 더욱 크게 증가하였다. 결과적으로 methylation능을 반영하는 지표인 SAM/SAH의 비율은 절식에 의해 4.34에서 2.55와 1.97로 감소하였다. 이 결과는 SAM/SAH의 비율에 영향을 받지 않는 glycine methyltransferase를 제외한 대부분의 methylation 반응이 절식에 의해 억제됨을 시사한다.
- 반대로 SAM의 methylation 반응생성물인 SAH의 농도는 24시간 절식에 의해 24.5±1.8 nmol/g liver에서 32.6±1.6 nmol/g liver로 증가하였으며 절식시간을 48시간으로 연장할 경우 38.3±0.8 nmol/g liver로 더욱 크게 증가하였다.
- 현재의 연구결과로 MAT의 활성증가에도 불구하고 SAM의 농도가 감소한 기전은 불분명하다. 본 연구결과는 SAM이 CBS의 allosteric activator인 점을 고려할 때 SAM의 감소가 homocysteine으로부터 cystathionine의 합성을 억제하여 methionine의 농도 유지에 기여할 수 있음을 시사한다.10)
- 이 결과는 절식상태에서 간의 GSH 농도는 감소한 반면 GCL의 발현에는 변화가 없다는 Lu 등의5) 보고와 일치한다. 본 연구에서 GSH의 농도는 감소한 반면 제한 기질인 cysteine은 오히려 증가하였다. 이상의 연구결과는 절식 상태에서 GSH의 감소가 합성의 감소와는 무관함을 시사한다.
- 2) 즉, cysteine의 증가는 CDO의 활성을 증가시키며 결과적으로 세포에서 cysteine의 축적을 억제하고 황함유 아미노산의 최종 배설체인 taurine의 합성을 촉진한다. 본 연구에서 cysteine의 농도는 절식에 의하여 증가하였으며 증가폭은 절식시간에 의존적이었다. 이 결과는 cysteine의 증가가 CDO의 발현을 조절한다는 Stipanuk의2) 연구 결과를 지지한다.
- 본 연구에서 절식은 황함유 아미노산 및 이들의 대사체 함량과 methionine의 transulfuration을 매개하는 효소의 활성에 현격한 변화를 유발하였다. 특징적으로 BHMT의 활성 증가와 CBS의 활성 감소는 homocysteine의 methylation 반응을 촉진하여 절식상태에서 methionine 함량의 유지에 기여하였다.
- 반면 homocysteine의 methylation을 촉매하여 methionine으로 전환시키는 BHMT의 활성은 절식에 의해 현격하게 증가하였으며 증가폭은 절식시간에 의존적이었다. 이 결과는 절식상태에서 methionine의 농도를 유지하기 위해 비가역적인 과정인 homocysteine에서 cystathionine으로의 전환을 억제하고 methionine의 재생산과정인 homocysteine의 methylation 반응이 활성화되었음을 보인다. 본 연구결과는 BHMT가 methionine의 농도를 유지에 중요한 역할을 수행한다는 Finkelsteine 등의11) 연구결과를 지지한다.
- 본 연구에서 GSH의 농도는 감소한 반면 제한 기질인 cysteine은 오히려 증가하였다. 이상의 연구결과는 절식 상태에서 GSH의 감소가 합성의 감소와는 무관함을 시사한다. 간에서 합성된 GSH의 대부분은 혈액을 통하여 유리되거나 일부는 담즙으로 분비된다.
- 절식상태에서 GSH의 감소는 합성과 무관한 간에서의 배출증가 등 다른 기전을 통하여 유발되었으며 cysteine의 증가는 CDO의 유도를 통하여 taurine의 합성을 증가시킨 것으로 보인다. 절식상태에서 MAT의 활성은 증가하였음에도 불구하고 SAM의 농도는 감소하였다. 이 결과는 절식상태에서 SAM의 농도가 감소한 기전을 규명하기 위한 추가적인 연구가 필요함을 시사한다.
- 황함유 아미노산 및 이들의 대사체는 세포의 생리적인 기능을 유지하기 위한 필수적인 역할을 수행하여 이들 물질의 대사에 이상이 발생할 경우 심각한 질환을 초래한다. 혈액에서 homocysteine의 농도가 증가하는 hyperhomocysteinemia 환자는 CBS의 유전적인 결함 등에 의해 발생하며 혈액에서 homocysteine의 증가는 심혈관계질환을 유발하는 중요한 인자로 확인되었다.6) GSH는 산화적 손상에서 세포를 보호하며 cysteine의 수송체 또는 저장체로 기능한다.
후속연구
- 절식상태에서 MAT의 활성은 증가하였음에도 불구하고 SAM의 농도는 감소하였다. 이 결과는 절식상태에서 SAM의 농도가 감소한 기전을 규명하기 위한 추가적인 연구가 필요함을 시사한다.
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