Fenitrothion 분해미생물 Bacillus sphaericus NFo1의 동정 및 분해 최적조건 Identification and Cultural Optimization of the Fenitrothion-degrading Microorganism, Bacillus sphaericus NFo1원문보기
유기인계 살충제인 fenirothion에 의하여 생성되는 폐기물과 폐수를 생물적 방법으로 처리하는 방법을 찾기 위하여 fenitrothion 분해미생물을 이용하는 연구를 수행하였다. 이 미생물은 fenitrothion을 함유하는 NB 선택배지를 이용하여 분리되었으며, Gram(+), 막대형, 포자형성 등의 형태적, 생화학적 특징들에 근거하여 Bacillus sphaericus NFo1으로 동정되었다. NB 배지에서 fenitrothion을 분해하는 최적 배양조건 혹은 농약 분해 조건을 결정하는 연구를 수행한 결과 최적 배양온도, 초기 pH, 균체 접종량이 각각 $35^{\circ}C$, 7.5, $OD_{660}$ 값이 1.5인 균체량으로 결정되었다. 이상의 최적 분해조건에서 fenitrothion은 5일 이내에 200mg/L의 고농도 배양에서도 90% 이상이 분해됨을 확인하였다.
유기인계 살충제인 fenirothion에 의하여 생성되는 폐기물과 폐수를 생물적 방법으로 처리하는 방법을 찾기 위하여 fenitrothion 분해미생물을 이용하는 연구를 수행하였다. 이 미생물은 fenitrothion을 함유하는 NB 선택배지를 이용하여 분리되었으며, Gram(+), 막대형, 포자형성 등의 형태적, 생화학적 특징들에 근거하여 Bacillus sphaericus NFo1으로 동정되었다. NB 배지에서 fenitrothion을 분해하는 최적 배양조건 혹은 농약 분해 조건을 결정하는 연구를 수행한 결과 최적 배양온도, 초기 pH, 균체 접종량이 각각 $35^{\circ}C$, 7.5, $OD_{660}$ 값이 1.5인 균체량으로 결정되었다. 이상의 최적 분해조건에서 fenitrothion은 5일 이내에 200mg/L의 고농도 배양에서도 90% 이상이 분해됨을 확인하였다.
A study was carried out to find out the methodology of biological treatment for wastes and wastewater caused by an organophosporus insecticide, fenitrothion, using fenitrothion-degrading microorganism. A fenitrothion-degrading microorganism was isolated by using a selective nutrient broth (NB) mediu...
A study was carried out to find out the methodology of biological treatment for wastes and wastewater caused by an organophosporus insecticide, fenitrothion, using fenitrothion-degrading microorganism. A fenitrothion-degrading microorganism was isolated by using a selective nutrient broth (NB) medium including fenitrothion, and identified to Bacillus sphaericus NFol based on its morphological and biochemical characteristics. Further, investigation was processed to determine the optimal culture conditions degrading fenitrothion in NB medium by using the NFo1 strain. As results, the cultural conditions determined for temperature, initial pH and inoculum for the optimum growth of the strain and degradation of fenitrothion, which has a exact co-relationship between both of them, were $35^{\circ}C$, 7.5 and 1.5 at $OD_{660}$ value, respectively. In this conditions, fenitrothion could be degraded within 5 days over 90% at the high concentrations of fenitrothion, upto 200 mg/L.
A study was carried out to find out the methodology of biological treatment for wastes and wastewater caused by an organophosporus insecticide, fenitrothion, using fenitrothion-degrading microorganism. A fenitrothion-degrading microorganism was isolated by using a selective nutrient broth (NB) medium including fenitrothion, and identified to Bacillus sphaericus NFol based on its morphological and biochemical characteristics. Further, investigation was processed to determine the optimal culture conditions degrading fenitrothion in NB medium by using the NFo1 strain. As results, the cultural conditions determined for temperature, initial pH and inoculum for the optimum growth of the strain and degradation of fenitrothion, which has a exact co-relationship between both of them, were $35^{\circ}C$, 7.5 and 1.5 at $OD_{660}$ value, respectively. In this conditions, fenitrothion could be degraded within 5 days over 90% at the high concentrations of fenitrothion, upto 200 mg/L.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구에서는 선발된 균주 중에서 fenitrothion 분해력이 우수한 NFol 균주의 동정, 배양특성 및 fenitrothion 분해율 향상을 위한 배양최적화를 실시하여 실용적 적용 여부를 검정하고자 한다.
본 연구팀은 농약폐수나 농약살포 후 토양중에 잔류된 fenitrothion을 효율적으로 처리하기 위한 방안의 하나로 논밭, 임야 및 오염지 토양, 폐수 등의 다양한 미생물에서 fenitrothion 분해력이 우수한 미생물 균주를 탐색하여 그 결과를 이미 보고한 바 있다(최 등, 1998).
제안 방법
Fenitrothion 처리농도에 따른 분해율을 결정하기 위하여 100 mL flask에 각각 50, 100, 200, 400, 800, 1, 600 mg/L의 fenitrothion이 첨가된 NB 액체배지를 각각 20 ml씩 넣고, 전배양한 시험균주 1 mL을 접종하였다. 접종한 flask는 35C 로 조절된 각 배양기에서 150 rpm으로 5일간 진탕 배양한 후 배양액 전량을 취하여 fenitrothion 분해율을 측정하였다.
NFol 균주를 동정하기 위하여 먼저 Gram 염색 후, 편광현미경으로 형태적 특성을 관찰하였다. 다음 단계료 동정용 kit를 사용하여 보다 자세한 동정을 수행하였다.
NFol 균주배양이 끝난 flask의 배양액 전량을 취해 동량의 n-hexane으로 2회 분배추출하고 상등액 인 n-hexane 층만을 분리, GLC로 fenitrothion 잔량을 분석하였다. 미생물에 의한 fenitrothion 분해율은 다음의 식에 의하여 % 분해율을 계산하였으며, fenitrothion을 정량적으로 측정하기 위한 GLC 분석조건은 Table 1과 같다.
동정방법은 각 카드에 동정하고자 하는 단독 colony의 균액을 채워 carousel tray에 넣고 5~ 10분간 반응 후 다시 카드를 reader/incubator tray에 넣고 Vitek operators 절차에 따라 동정하였다. 그리고 최종적으로 시험균주는 주사형 전자현미경(Hitachi S-4300) 으로 균주의 모양, 크기, 편모 등을 관찰하였다.
또한 최적 균체 접종량을 결정하기 위하여 동일한 방법으로 제조한 배지에 2일간 전배양한 NFol의 OD660값이 0.5, 1.0, 1.5에 해당하는 값으로 각각 1 mL씩 접종하였다. 접종한 flask는 최적온도로 조절된 각 배양기에서 150 rpm으로 5일간 진탕 배양한 후 배양액 전량을 취하여 fenitrothion 분해율을 측정하였다.
배지의 초기 최적 pH를 결정하기 위하여 동일한 방법으로 제조한 배지에 초기 pH를 IN HC1 과 IN Na0H로 3.5, 5.5, 7.5, 9.5로 각각 조절하여 전배양한 NFol을 1 mL 접종한 후, 35°C에서 150 rpm으로 5일간 진탕 배양한 후 배양액 전량을 취하여 fenitrothion 분해율을 측정하였다.
시험균주 1 mL을 접종하였다. 접종한 flask는 35C 로 조절된 각 배양기에서 150 rpm으로 5일간 진탕 배양한 후 배양액 전량을 취하여 fenitrothion 분해율을 측정하였다.
5에 해당하는 값으로 각각 1 mL씩 접종하였다. 접종한 flask는 최적온도로 조절된 각 배양기에서 150 rpm으로 5일간 진탕 배양한 후 배양액 전량을 취하여 fenitrothion 분해율을 측정하였다.
최적 배양시간의 결정은 동일한 방법으로 제조한 배지에 NFO1을 접종한 후, 35°C로 조절된 각 배양기에서 150 rpm 으로 5, 10, 15, 30일간 진탕 배양한 후 배양액 전량을 취하여 fenitrothion 분해율을 측정하였다.
최적 배양온도를 결정하기 위하여 Erlenmeyer flask(100 mL)에 100 mg/L {fenitrothion이 첨가된 NB 액체배지를 각각 20 mL씩 넣고, NFol 균주를 NB 액체배지에서 2일간 전 배양한 배양액 1 mL을 취하여 접종하였다. 접종된 flask는 15, 20, 25, 30, 35°C에서 150 rpm으로 5일간 진탕 배양한 후 배양액 전량을 취하여 fenitrothion 분해율을 측정하였다.
또한 액체배양인 경우 NA 배지에서 agar만을 제외한 NB 액체배지를 제조하여 사용하였다. 한편 fenitrothion 분해능 검정을 위해서는 NB 배지에 적당량의 fenitrothion을 첨가하여 제조한 배지를 사용하였다.
대상 데이터
사용된 배지는 고체배양인 경우 nutrient agar(NA) 배지 (beef extract 3 g, peptone 3 g, agar 12 g/L)를 사용하였다. 또한 액체배양인 경우 NA 배지에서 agar만을 제외한 NB 액체배지를 제조하여 사용하였다. 한편 fenitrothion 분해능 검정을 위해서는 NB 배지에 적당량의 fenitrothion을 첨가하여 제조한 배지를 사용하였다.
본 연구에 사용된 미생물은 임야토양에서 분리한 fenitrothion 분해능이 매우 우수한 NFol 균주를 사용하였다. 사용된 배지는 고체배양인 경우 nutrient agar(NA) 배지 (beef extract 3 g, peptone 3 g, agar 12 g/L)를 사용하였다.
매우 우수한 NFol 균주를 사용하였다. 사용된 배지는 고체배양인 경우 nutrient agar(NA) 배지 (beef extract 3 g, peptone 3 g, agar 12 g/L)를 사용하였다. 또한 액체배양인 경우 NA 배지에서 agar만을 제외한 NB 액체배지를 제조하여 사용하였다.
시험농약인 fbnitrotmon(상표명: 스미치온)은 시중에 시판되고 있는 50% 유제를 구입하여 사용하였으며, 분석용 fenitrothion 표준품(순도: 95.0%)은 (주)동방아그로에서 분양 받아 사용하였다.
성능/효과
2). 그리고 이 균주에 의한 최대 분해율은 15"C에서의 분해율에 비해 약 4배 정도 높은 것으로 나타났다.
B. sphaericus NFol 에 의한 초기 pH에 따른 fenitrothion 분해율을 비교한 결과 fenitrothion 분해율은 초기 pH가 3.5~ 7.5까지 높아질수록 증가하였으나, pH 9.5에서는 fenitrothion 분해율이 낮아졌기 때문에 이 균주는 중성 PH에서 생육과 fenitrothion 분해가 적합한 중성균주로 판단된다(Fig. 3). pH 7.
Fenitrothion 분해력이 우수한 NFol 균주의 접종량에 따른 fenitrothion 분해율을 비교한 결과 시험균주는 0.660L5의 접종량에서 73.2%로 최대분해율을 보였으며, 접종량이 많아질수록 fenitrothion 분해-율이 높았다(Fig. 4).
Fenitrothion 분해력이 우수한 미생물 중 최종 선발된 세균 NFol의 배양온도에 따른 fenitrothion 분해율을 비교한 결과이 균주는 30~35°C에서 농약 분해율이 844~85.9%로 가장 높았다(Fig. 2). 그리고 이 균주에 의한 최대 분해율은 15"C에서의 분해율에 비해 약 4배 정도 높은 것으로 나타났다.
Fenitrothion 처리농도에 따른 분해율을 비교한 결과 fenitrothion 농도가 50~200 mg/L일 때 미생물에 의한 fenitrothion의 분해율을 보면 94.7~78.3%로 분해가 잘 되었으나 fenitrothion 농도가 400~1, 600 mg/L로 높아졌을 때 fenitrothion 분해율은 39.3~5.9%로 현저히 저하되었다 (Fig. 6).
로 확인되었다. 또한 이 card에 의해 분석된 다른 여러 생화학적 특성에 근거하여 이 균주는 최종적으로 Bacillus sphaericus NFol으로 99% 확률로 동정되었다(Table 2, Fig. 1).
시험균주 B. sphaericus NFol$] 배양일수에 따른 fenitrothion 분해율을 비교한 결과 배양일수 5일까지는 급격한 분해를 보였으나, 그 이후에는 분해가 매우 느리게 진행되었다(Fig. 5). 초기 100 mgJ의 fenitrothion; 5일 후 분해율이 84.
시험균주 NFol을 동정하기 위하여 Gram 염색하여 현미경으로 관찰한 결과 Gram(+), rod type의 균으로 획인되었다. Gram 양성세균 중 Bacillus 종만을 동정하기 위하여 사용되는 Vitek BAC card로 분석한 결과 이 균주는 spore를 형성하고, amylopectin을 분해할 수 있으며, 항생제 nalidixic acid에 민감한 전형적인 Bacillus sp.
0 mM이고, 50%의 생균수 감소를 보였다고 한다(김 등, 1995). 이상의 결과에서 농약 농도가 높아짐에 따라 미생물의 생육저해와 분해율 저하를 알 수 있는데 fenitrothioiie 가수분해 산물인 3-methyl-4-nitrophenol에 의한 미생물의 생육억제로 분해력 저하를 가져왔다고 생각된다. 하지만 NFol 균주는 ffenitrothion에 대해서 200 mg/L의 농도까지는 분해할 수 있는 능력이 있다고 사료된다.
참고문헌 (30)
Adhya, T. K., B. Sudhakar and N. Sethunathan (1981) Fate of fenitrothion, methyl parathion and parathion in anoxic sulfur-containing soil systems. Pestic. Biochem. Physiol. 16:14-20
Alonso, J. L., C. Sabater, M. J. Ibanez, I. Amoros, M. S. Botella and J. Carrasco (1997) Fenitrothion and 3-methyl-4-nitrophenol degradation by two bacteria in natural waters under laboratory conditions. J. Environ. Sci. Health. 32(3):799-812
Arthurs, Steven, Matthew B. Thomas and Juergen Langewald (2003) Field observations of the effects of fenitrothion and Metarhizium anisopliae var. acridum on non-target ground dwelling arthropods in the Sahel. Biological Control 26(3):333-340
Baarschers, W. H., J. Elvish and S. P. Ryan (1983) Adsorption of fenitrothion and 3-methyl-4-nitrophenol on soils and sediment. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 30:621-627
Baarschers, W. H. and H. S. Heitland (1986) Biodegradation of fenitrothion and fenitrooxon by the Fungus Trichoderma viride. J. Agric. Food Chem. 34:707 -709
Bruhn, C., H. Lenke and H. J. Knackmuss (1987) Nitrosubstituted aromatic compounds as nitrogen source for bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 53(1):208-210
Cheng, H. H. (1990) Pesticides in the soil environment : processes impacts and modeling. Soil Science Society of America:429-466
Farghaly, M. and S. El-Maghraby (2008) Toxicological evaluation and bioavailability of $^{14}C$ -fenitrothion bound residues on soybeans towards experimental animals. Food and Chem. Toxicol. 46(9):3111-3115
Hayes, W. J. and E. R. Laws (1991) Handbook of pesticide toxicology. Academic Press, Inc
Hill I. R. and S. J. L Wright (1978) Pesticide microbiogy. Academic Press. London: 79-136
MacRae, I. C. (1989) Microbial metabolism of pesticides and structurally related compounds. Rev. Environ. Contam. Toxico. 109:1-88
Ozaki, M. and S. Kuwatsuka (1986) Reproductive degradation of the herbicide isouron and its related compounds by Pseudomonas putida. J. Pesticide Sci. 11(3):427-432
Sato, Y. (1992) Degradation of fenitrothion by bacteria isolated from forest soil. J. Jpn. For. Soc. 74(6):482-487
Schoen, S. R. (1987) The effects of various soil factors and amendments on the degradation of pesticide mixtures. J. Environ. Sci. Health 22(3):347-377
Worthing, C. R. (1991) The pesticide manual. ninth edition, The British Crop Protection Council
Wright, J. A., M. W. Hermonat and R. G. Hards (1982) A degradation product of fenitrothion, 3-methyl-4-nitrophenol, is an inhibitor of mammalian ribonucleotide reductase. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 28:480-483
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.