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문제 정의
- 12) 독성이 있는 endosulfan sulfate는 토양에 상당 기간 잔류하는데 이는 주로 endosulfan의 화학구조 중에 있는 chloline group의 탈염소화(dechlorination)가 잘 일어나지 않기 때문인 것으로 보고되고 있다.11,13) 따라서 본 연구에서는 endosulfan을 분해하면서도 endosulfan sulfate는 형성시키지 않는 성질을 가진 미생물의 분리에 중점을 두어 미생물 분해 산물에 의한 독성증가를 막고자 하였다.
- 본 연구에서는 이러한 미생물학적 처리법 개발의 기초단계로써, 우리나라 농경지 토양을 집식배양(enrichment culture)하여 endosulfan 분해능을 확인하고 단독으로 이를 분해 할 수 있는 분해 균주를 분리하여 그 특성을 파악하였다.
제안 방법
- 05%의 yeast extract를 넣어 사용하였다. BSM은 liter당 2 g의 KH2PO4, 7.5 g의 K2HPO4, 1 g의 NH4Cl, 0.5 g의 NaCl, 0.1 g의 MgSO4･7H2O, 1 mg의 nicotinic acid에 10 ml의 trace element solution(TES)을 첨가하여 pH 6.8로 조제하였으며 여기에 0.5 g의 yeast extract와 100 mg의 endosulfan(순도 99.5%), 그리고 분산제로서 0.5 ml의 Tween80을 첨가하여 제조하였다. TES 용액은 liter 당 20 mg의 (NH4)6Mo7O24･4H2O, 50 mg의 H3BO3, 30 mg의 ZnCl2, 3 mg의 CoCl2･6H2O, 10 mg의 (CH3COO)2Cu･H2O 그리고 20 mg의 FeCl2･6H2O .
- 3은 분리된 Bacillus sp. E64-2를 10 mg/L의 endosulfan이 첨가된 1/10 LB 배지에서 생육시키며 그 증식상태와 endosulfan 분해 활성을 측정한 것이다. 분리균 Bacillus sp.
- 분리균 Bacillus sp. E64-2에 의한 endosulfan의 분해 혹은 전환이 미생물이 가진 자체의 효소 작용에 의한 것인지 알아보기 위하여 10 mg/L의 endosulfan이 함유된 1/10 LB 배지에서 각각 1일과 3일, 7일간 배양된 E64-2의 배양액 50 ml에 포함된 균체를 원심집균하고 PBS buffer(0.8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.48% KH2PO4, pH 7.0)로 2회 세척하여 배지 성분을 제외한 배양 세포만을 모았다. 모아진 배양 세포는 5 ml의 PBS buffer에 현탁하여 초음파 파쇄 후 원심분리하여 불용성 성분을 제거한 뒤 상징액을 endosulfan 분해 실험을 위한 조효소액으로 사용하였다.
- Endosulfan을 분해할 수 있는 단독 미생물은 Kim 등의8) 방법을 응용하여 분리하였다. 집식배양에서 endosulfan의 분해능이 큰 것으로 나타난 시험구를 15,000 rpm에서 10분간 원심집균하고 BSM 액체배지로 2회 세척하였다.
- 집식배양에서 endosulfan의 분해능이 큰 것으로 나타난 시험구를 15,000 rpm에서 10분간 원심집균하고 BSM 액체배지로 2회 세척하였다. 모아진 미생물 균체중 적량을 100 mg/L의 endosulfan과 0.05% Tween 80이 함유된 BSM 한천평판배지에 도말하여 30℃에서 배양하면서 생성된 콜로니를 순수 분리 하였다.
- 방법을 변형한 분자생물학적인 방법으로 동정하였다. 미생물로부터 염색체 DNA를 분리한 후 이를 주형으로 한 PCR로 16s ribosomal DNA를 증폭하였다. 이 때 PCR primer로는 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’-GTTACCTTGTTACGACTT-3’)을 사용하였다.
- 배양 배지 5 ml를 각 pH 별 (pH 3.0-9.0)로 조건을 맞추고 여기에 10 mg/L의 endosulfan을 넣어 30℃에서 24시간 정치 후 상등액을 GC분석하였다.
- 선발 균주들의 endosulfan 분해활성을 측정하기 위하여 분리된 10종의 균주를 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 10 mg/L의 endosulfan이 함유된 1/10 LB 배지에 접종하여 30℃에서 7일간 배양한 후 endosulfan의 분해도를 조사하였다. Table 1에서 보는 바와 같이 선발된 10종의 균주 배양액 모두에서 endosulfan이 줄어들고 diol이 생성되었다.
- 선별된 endosulfan 분해 미생물들의 endosulfan 분해활성을 조사하기 위하여 분리된 미생물을 10 mg/L 농도의 endosulfan을 첨가한 1/10 LB 배지(0.1% tryptone, 0.05% yeast extract, 0.5% NaCl)에 접종하여 30℃, 150 rpm으로 7일간 배양한 후, Fig. 1과 같이 endosulfan과 여러가지 분해 산물을 가스크로마토그래피(Varian 3400CX equipped with 63Ni electron capture detector and Rtx-5 capillary column [0.25 mm(inside diameter) by 30 m; 0.25 ㎛ film thickness; RESTEK, USA])로 분석하였다.
- 이들 14점의 diol 생성 시료에 대하여 다시 한 번 동일 실험을 반복하여 endosulfan 분해 능력이 좋은 시료 4점을 최종 선별하였다. 선별된 시료는 집식배양에 사용한 BSM 한천평판배지에 도말하여 단일 colony를 얻은 후 이들을 3회 계대배양하여 총 10종의 미생물 균주를 순수 분리하였다.
- 실제로 배양액 중의 알칼리 조건에서 endosulfan이 endosulfan diol로 전환되는지 알아보기 위하여 균체없이 각 pH 별로 제조한 배양 배지만을 가지고 endosulfan의 전 환을 알아보았다. 배양 배지 5 ml를 각 pH 별 (pH 3.
- E64-2가 배양액중의 pH를 변화시키는지 알아보았다. 실험은 endosulfan 분해 실험과 동일한 조건으로 일주일간 배양하며 매 24시간마다 pH 변화를 조사하였다. Figure 3에서 보는 바와 같이 , pH 7.
- 25 ㎛ film thickness; RESTEK, USA])로 분석하였다. 이때 시료 접종액을 넣지 않은 실험구를 대조군으로 함께 실험하여 endosulfan의 화학적 분해 요인을 보정하였다.
- 이 때 PCR primer로는 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’-GTTACCTTGTTACGACTT-3’)을 사용하였다. 증폭된 DNA는 cloning하여 염기서열을 분석한 후 Ribosomal Database Project site(http:// rdp.cme.msu.edu/index.jsp)와 MEGA4 program을 이용한 계통분류학적 비교분석을 통하여 균주를 동정하였다.
- 집식배양은 90 ml의 집식배지에 10 ml의 접종액을 넣고 30℃, 150 rpm으로 2주 이상 진탕배양하며 균의 생육 여부를 육안 관찰하였다. 1차 집식배양이 끝난 후 배양액 1 ml를 취하여 신선한 집식배지 100 ml에 다시 접종한 후 동일 조건에서 2차 집식배양을 실시하였다.
- 효소에 의한 endosulfan의 분해 실험은 분리균을 1/10 LB배지에서 10 mg/L endosulfan으로 1-7일간 유도하여 생육시킨 균체를 파쇄하여 조효소액을 만들고 이렇게 얻어진 조효소액에 endosulfan을 최종농도 10 mg/L이 되도록 첨가하여 30℃에서 24시간 동안 반응하고 GC로 반응산물을 분석하여 진행하였다.
대상 데이터
- Endosulfan 분해균주의 분리를 위한 시료는 endosulfan의 사용여부를 조사하여 대구, 경북, 경남 일대의 농경지와 야산에서 채취된 140점의 토양 시료와 금호강과 낙동강 하천에서 채취된 17점의 진흙, 각종 퇴비에서 채취된 13점의 시료, 동해안 및 남해안의 양식장 인근 고농도 침출액 5점과 염료공장의 하수구 인근에서 채취된 5점의 진흙, 그리고 식품 가공 공장의 폐액 3점 등을 포함하여 총 182점을 채취하였다. 채취된 토양시료는 집식배양(enrichment culture)에 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
- 본 연구에 사용한 technical grade endosulfan(순도 99.5% 이상)과 그 대사 산물의 표준품인 endosulfan sulfate, endosulfan diol, endosulfan lactone, endosulfan ether 등은 Riedel-deHaen사(Seelze,독일)로부터 구입하여 사용하였으며 분해산물의 추출과 가스크로마토그래피(GC) 분석에 사용한 n-hexane 및 acetone, methanol, dichloromethane 등은 Merck사(USA)의 분석용 시약(순도 99.9% 이상)을 사용하였다.
- 이 때 PCR primer로는 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’-GTTACCTTGTTACGACTT-3’)을 사용하였다.
- Endosulfan 분해활성이 확인된 시료 중 주로 diol을 형성한 그룹은 sulfate를 형성하지 않았으며 대부분의 endosulfan을 분해시킨 것으로 나타났다. 이들 14점의 diol 생성 시료에 대하여 다시 한 번 동일 실험을 반복하여 endosulfan 분해 능력이 좋은 시료 4점을 최종 선별하였다. 선별된 시료는 집식배양에 사용한 BSM 한천평판배지에 도말하여 단일 colony를 얻은 후 이들을 3회 계대배양하여 총 10종의 미생물 균주를 순수 분리하였다.
이론/모형
- 집식배양용 배지는 Lee등의7) 방법을 참고하여 BSM배지에 100 mg/L의 endosulfan과 0.05%의 yeast extract를 넣어 사용하였다. BSM은 liter당 2 g의 KH2PO4, 7.
성능/효과
- 생물학적 요인에 의한 endosulfan의 분해는 Figure 1B에서와 같이 endosulfan sulfate를 경유하는 것으로 보고되고 있으나 높은 pH에서의 가수분해작용과 같은 화학적 요인도 생물학적 요인과 결합하여 나타나는 것으로 추측되고 있다.14) 따라서 본 논문의 분리균에 의한 endosulfan diol의 생성 및 분해는 효소작용과 더불어 배양액의 pH가 증가하는 성질에서 기인하는 것으로 판단된다.
- Endosulfan 분해활성이 확인된 시료 중 주로 diol을 형성한 그룹은 sulfate를 형성하지 않았으며 대부분의 endosulfan을 분해시킨 것으로 나타났다. 이들 14점의 diol 생성 시료에 대하여 다시 한 번 동일 실험을 반복하여 endosulfan 분해 능력이 좋은 시료 4점을 최종 선별하였다.
- 집식배양에 사용된 182점의 시료 중 1차 및 2차 집식배양액에서 균의 생육이 확인된 시료는 144점이었다. 균의 생육이 있는 집식배양액의 endosulfan 농도를 GC로 분석한 결과 모든 실험구에서 40%에서 100% 수준으로 endosulfan 농도가 감소하였다.
- 선발된 균주 E64-2를 동정하기 위하여 그람염색을 실시한 결과 그람 양성의 간균으로 판명되었다. 보다 구체적인 동정을 위하여 이 균의 16s rDNA sequence를 cloning하여 염기서열을 결정하고 계통분석을 한 결과 분리균주 E64-2는 Bacillus thuringiensis나 Bacillus cereus와 99% 이상의 근연관계를 가지고 있는 균으로 나타났다[Fig. 2]. 두 종의 미생물들은 실제로 서로의 아종으로 분류되기도 할 정도로 근연관계에 있으며 토양환경 중에서 흔히 발견되고 있다.
- 선발된 균주 E64-2를 동정하기 위하여 그람염색을 실시한 결과 그람 양성의 간균으로 판명되었다. 보다 구체적인 동정을 위하여 이 균의 16s rDNA sequence를 cloning하여 염기서열을 결정하고 계통분석을 한 결과 분리균주 E64-2는 Bacillus thuringiensis나 Bacillus cereus와 99% 이상의 근연관계를 가지고 있는 균으로 나타났다[Fig.
- Table 2에서와 같이 균주 E64-2의 endosulfan 유도 1일째의 조효소액으로는 endosulfan의 분해가 거의 일어나지 않았으나 endosulfan 유도 3일차와 7일차의 조효소액은 endosulfan을 endosulfan diol로 일부 전환하는 능력을 나타내었다. 이 실험 결과로 볼 때 균주 E64-2가 가진 효소 혹은 효소 복합체는 endosulfan을 endosulfan diol로 전환하여 분해시키는 것으로 추정된다. 조효소액은 살아있는 세포가 아니므로 시간이 지남에 따라 활성을 잃어버리는 효소의 수준을 유지할 수 없는 상태이므로 생세포에 비해 상대적으로 분해 활성이 낮게 나온 것으로 보인다.
- 이들은 GC 확인 결과 주된 분해 산물로 endosulfan sulfate, diol, ether 등을 각각 가지는 집식배양 실험구들로 분류되었다. 조사된 144점의 시료중에서 endosulfan sulfate를 분해 산물로 가지는 시료가 총 25점, endosulfan diol을 분해산물로 가지는 시료가 14점이었고 나머지 시료에서는 endosulfan의 감소는 있으나 2차 산물이 발견되지 않았거나 적은 양의 ether가 일부 발견되었으며 이러한 특성은 시료를 채취한 지역별로 거의 동일하게 나타났으므로 각 지역이나 환경의 토착 미생물 분포에 따라 endosulfan 분해 양상도 다르게 나타나는 것으로 생각되었다.
후속연구
- 4로 올릴 수 있었다. 이러한 효소활성과 pH 증가 능력은 분리균주 E64-2에 의한 endosulfan 분해의 주된 작용 인자인 것으로 판단되며 이 균주는 효소에 의한 분해작용과 pH 상승작용을 통하여 토양에 잔류하는 난분해성 물질인 endosulfan을 bioremediation하기 위한 연구의 기초 균주로서의 가치가 있을 것으로 판단된다.
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