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문제 정의
- 최근 폐섬유화에 대한 前胡를 이용한 연구 등7) 단미를 통한 연구는 진행되고 있지만 처방및 복합제에 대한 연구는 없어 노인 氣虛外感咳嗽에 사용되는 오과다에 배를 첨가하여 폐 섬유화 과정 중 발현되는 인자 중 TGF-beta, 포스포디에스터레이즈(phosphodiesterase 5A), interleukin을 대상으로 어떤 기전을 통해 치료에 영향을 줄 수 있는 지에 대해서 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 오과다 분말을 (200 mg/kg body weight/day) 증류수에 녹인 후 처음 블레오마이신을 투여한 날부터 21일째 처음 경구 투여 하였다. 21일째부터 1일 간격으로 7 차례에 걸쳐 경구 투여하였다.
- 그리고 나서 점들을 TGF-beta, phosphodiesterase 5A, interleukin(4,5,13)의 항체와 약 4℃에서 하루 동안 배양하였다. Anti-rabbit horseradish peroxidase conjugated IgG를 항체와 결합 유무를 알기 위해서 사용하였다.
- 밤은 溫鹹하여, 補氣하고, 神氣를 補한다. 外氣 즉 感氣의 기운이 없으면 생밤 대신 마른 밤을 넣으라고 하여 본 처방에서는 마른 밤을 사용하였다1). 대조는 補脾和胃·養血安神·緩和藥性 등의 효능이 있어 脾虛少食, 脾弱便溏, 氣血津液不足, 血行不和, 營衛不和, 心悸怔忡, 婦人臟躁 등의 병증을 치료하므로 대부분의 방제에 포함된다.
- 대조군의 경우에는 생리식염수 30 μL를 기도 내로 주입하였고, 실험군에는 10 mg/kg의 bleomycin hydrochloride(Nippon Kayaku Co., Tokyo, Japan)을 30 μL의 생리식염수에 섞어 기도 내로 주입하였다.
- 컴퓨터를 작동시킨 후 softmax program에서 595nm으로 읽었다. 베타-엑틴을 기준으로 각 그룹에서 나타나는 띠의 모양을 비교해 봄으로써 오과다가 폐 섬유화에 미치는 영향을 평가하였다.
- , Tokyo, Japan)을 30 μL의 생리식염수에 섞어 기도 내로 주입하였다. 블레오마이신을 투여한 후 6주 후에 쥐를 희생시켜 웨스턴 블롯을 시행하였다8) (Fig. 1)
- 8L을 환저플라스크에 넣고, 냉각기를 부착하여 2시간 전열기로 증탕한 후 3,000rpm에서 20분간 분리하고 진공압축기로 감압 농축한 후 동결건조기에서 24시간동안 동결 건조하여 20g의 분말시료를 얻었다. 오과다 분말을 (200 mg/kg body weight/day) 증류수에 녹인 후 처음 블레오마이신을 투여한 날부터 21일째 처음 경구 투여 하였다. 21일째부터 1일 간격으로 7 차례에 걸쳐 경구 투여하였다.
- 병원체 감염이 되지 않은 20∼25 g의 수컷 C57BL/6 쥐(Daejeon, Korea)를 이용하여 전북대학교 동물실험윤리위원회에 승인을 받아 연구를 시행하였다. 쥐는 티오펜탈소디움(thiopental sodium, 0.08 mL/kg of body weight)을 복강 내에 주입하여 마취한 후 기관 삽관을 시행하였다. 대조군의 경우에는 생리식염수 30 μL를 기도 내로 주입하였고, 실험군에는 10 mg/kg의 bleomycin hydrochloride(Nippon Kayaku Co.
대상 데이터
- 방약합편에서는 호두 10개, 은행 15개, 대추 7개, 밤 7개, 생강 1덩어리로 기술되어 정확한 양을 측정할 수 없어서 본 실험에서는 위 기술된 개수를 평균 무게로 환산하여 사용하고 배는 650g-700g 정도 크기의 배를 구입하여 후 아이들이 쉽게 음용하도록 하기 위해서 당도를 조절하여 3.5개를 사용하였고 재료는 모두 국산을 사용하였다(Table 1).
- 본 실험에서는 방약합편 오과다의 구성인 호두, 밤, 은행, 생강, 대조에 방약합편 중통 51편 風寒에 상하여 咳嗽 痰盛한 것을 치료하는 梨硼膏의1) 주재료인 배를 더하여 사용하였다.
- 오과다는 원광 대학교 익산 한방 병원(Iksan, Chonbuk, Korea)에서 구입하였다 (Table 1). 2405g 에 3차 증류수 1.
- 이렇게 해서 만들어진 혼합물을 2시간 동안 얼린 후 다시 12,000 × g로 30분 동안 원심 분리 하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해서 생성된 현탁액 (30㎎ of protein per lane)- TGF-beta, phosphodiesterase 5A, interleukin 4,5,13 (Santa Cruz Biotechnology)를 검출하기 위해서 핵단백질을 용해하는 데 사용- 10% SDS-PAGE 젤에 놓았다.
이론/모형
- 분해된 단백질은 90분 동안 120V로 전기영동을 한 후 wet transfer 방법에 의해 polyvinylidene difluoride membranes (Amersham Pharmacia Biotech)로 이동하였다. 비 특이적인 위치가 TBST buffer (25 mM Tris, pH 7.
- 특이 항체와의 결합은 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하였으며 Albumin standard(BSA)는 one albumin standard(BSA) ampule을 희석하여 사용하였다. 5ul 씩 3번 시행할 수 있는 양을 만들기 위해서 샘플을 1/10으로 희석한 후 96well testplate에 5ul 씩 놓고, PIERCE 23200, Coomassie(Bradford) protein assay kit에 250ul을 놓은 후 30초 동안 흔들고 실내에 10분 동안 놓아두었다.
성능/효과
- TGF-beta의 경우 정상 쥐 그룹과 블레오마이신을 투여한 후 6주 쥐를 비교할 때 정상보다 블레오마이신을 투여한 경우에 더 많은 양이 검출되어 폐 섬유화가 유발됨을 알 수 있었다. 그러나 오과다를 투여한 쥐와 정상, 오과다를 투여하지 않은 쥐를 비교했을 때 검출된 TGF-beta의 양이 정상보다 증가되고, 오과다를 투여하지 않은 경우와 비슷한 정도로 검출되었다.
- interleukin 13의 경우에 정상 쥐 그룹과 블레오마이신을 투여한 후 6주 쥐를 비교할 때 정상보다 블레오마이신을 투여한 경우에 많은 양이 검출되어 폐 섬유화가 유발됨을 알 수 있었다. 또한 오과다를 투여한 쥐와 정상, 오과다를 투여하지 않은 쥐를 비교했을 때 검출된 interleukin 13의 양이 정상보다는 증가되었지만 오과다를 투여하지 않은 경우와 비교했을 때 interleukin 13의 양이 현저하게 감소되었다.
- interleukin 4의 경우에는 정상 쥐 그룹과 블레오마이신을 투여한 후 6주 쥐를 비교할 때 정상보다 블레오마이신을 투여한 경우에 많은 양이 검출되어 폐 섬유화가 유발됨을 알 수 있었다. 또한 오과다를 투여한 쥐와 정상, 오과다를 투여하지 않은 쥐를 비교했을 때 검출된 interleukin 4의 양이 정상과 비슷하고, 오과다를 투여하지 않은 경우와 비교했을 때에 interleukin 4의 양이 현저하게 감소되었다.
- phosphodiesterase 5A의 경우도 정상 쥐 그룹과 블레오마이신을 투여한 후 6주 쥐를 비교할 때 정상보다 블레오마이신을 투여한 경우에 약간 많은 양이 검출되어 폐 섬유화가 유발됨을 알 수 있었다. 그러나 오과다를 투여한 쥐와 정상, 오과다를 투여하지 않은 쥐를 비교 했을 때 검출된 phosphodiesterase 5A의 양이 정상보다 약간 증가되고, 오과다를 투여하지 않은 경우와 같은 양이 검출되었다.
- phosphodiesterase 5A의 경우도 정상 쥐 그룹과 블레오마이신을 투여한 후 6주 쥐를 비교할 때 정상보다 블레오마이신을 투여한 경우에 약간 많은 양이 검출되어 폐 섬유화가 유발됨을 알 수 있었다. 그러나 오과다를 투여한 쥐와 정상, 오과다를 투여하지 않은 쥐를 비교 했을 때 검출된 phosphodiesterase 5A의 양이 정상보다 약간 증가되고, 오과다를 투여하지 않은 경우와 같은 양이 검출되었다. 즉 폐 섬유화를 치료하는 데 오과다와 phosphodiesterase 5A는 연관이 없음을 예측 할 수 있다 (Fig 3).
- TGF-beta의 경우 정상 쥐 그룹과 블레오마이신을 투여한 후 6주 쥐를 비교할 때 정상보다 블레오마이신을 투여한 경우에 더 많은 양이 검출되어 폐 섬유화가 유발됨을 알 수 있었다. 그러나 오과다를 투여한 쥐와 정상, 오과다를 투여하지 않은 쥐를 비교했을 때 검출된 TGF-beta의 양이 정상보다 증가되고, 오과다를 투여하지 않은 경우와 비슷한 정도로 검출되었다. 즉 폐 섬유화를 치료하는 데 오과다와 TGF-beta는 연관이 없음을 예측 할 수 있다 (Fig 2).
- 또한 오과다를 투여한 쥐와 정상, 오과다를 투여하지 않은 쥐를 비교했을 때 검출된 interleukin 13의 양이 정상보다는 증가되었지만 오과다를 투여하지 않은 경우와 비교했을 때 interleukin 13의 양이 현저하게 감소되었다. 따라서 오과다가 interleukin 13의 양을 감소시킴으로써 폐 섬유화 치료에 효과가 있음을 예측 할 수 있다 (Fig 6).
- interleukin 13의 경우에 정상 쥐 그룹과 블레오마이신을 투여한 후 6주 쥐를 비교할 때 정상보다 블레오마이신을 투여한 경우에 많은 양이 검출되어 폐 섬유화가 유발됨을 알 수 있었다. 또한 오과다를 투여한 쥐와 정상, 오과다를 투여하지 않은 쥐를 비교했을 때 검출된 interleukin 13의 양이 정상보다는 증가되었지만 오과다를 투여하지 않은 경우와 비교했을 때 interleukin 13의 양이 현저하게 감소되었다. 따라서 오과다가 interleukin 13의 양을 감소시킴으로써 폐 섬유화 치료에 효과가 있음을 예측 할 수 있다 (Fig 6).
- interleukin 4의 경우에는 정상 쥐 그룹과 블레오마이신을 투여한 후 6주 쥐를 비교할 때 정상보다 블레오마이신을 투여한 경우에 많은 양이 검출되어 폐 섬유화가 유발됨을 알 수 있었다. 또한 오과다를 투여한 쥐와 정상, 오과다를 투여하지 않은 쥐를 비교했을 때 검출된 interleukin 4의 양이 정상과 비슷하고, 오과다를 투여하지 않은 경우와 비교했을 때에 interleukin 4의 양이 현저하게 감소되었다. 따라서 오과다가 interleukin 4의 양을 감소시킴으로써 폐 섬유화를 치료할 수 있음을 예측 할 수 있다 (Fig 4).
- 이 연구에서 블레오마이신에 의해 폐 섬유화가 된 경우 폐 섬유화에 관련이 있는 것으로 알려져 있는 TGF-beta, phosphodiesterase 5A, interleukin 4,5,13이 모두 발현되었지만, 이 중 오과다의 경우 interleukin 4와 13에만 영향을 줌을 알 수 있었으며, 이런 경로를 통해서 폐섬유화의 과정 중 염증 반응을 감소시킴으로써 폐 섬유화의 치료에 도움을 줄 것으로 예상할 수 있다. 이미 알려져 있는 것처럼 interleukin 4와 TGF-beta는 fibroblast를 자극해서 콜라젠의 합성을 증가시킴으로써 폐 섬유화를 일으키는 것으로 되어 있으며, interleukin 13은 대식세포나 단세포에서 생산되는 염증 싸이토카인의 생산을 억제하는 것으로 알려져 있지만 폐 섬유화에서도 증가되는 것으로 알려져 있다.
- . 이번 연구에서는 주변에서 음식으로 쉽게 접할 수 있고 만성기침 치료제 및 건강차로 소개되어 일상생활에서 널리 활용되는 오과다가 실제 만성 호흡기 질환을 치료하는 효과가 있다는 것을 실험을 통해 기전을 밝힌 것이 의미가 있다고 사료된다.
후속연구
- 오과다는 폐 섬유화의 염증을 일으키는 다양한 인자 중 interleukin 4,13을 억제함으로써 폐 섬유화를 억제할 수 있음을 알 수 있으며, 이런 기전을 이용해서 향후 오과다가 알레르기 질환에 발현되는 인자 중 어떤 인자를 억제할 수 있는지를 밝힌다면 소아 알레르기 환자에게 사용할 수 있는 근거를 마련할 수도 있을 것으로 생각된다.
- 이 실험의 제한점으로는 오과다를 투여한 후 기관지 세척을 통해서 다양한 세포의 변화를 측정하지 못했고, 또한 블레오마이신을 투여한 후 발생한 폐 섬유화 과정이나 오과다를 투여한 후 폐 섬유화가 얼마나 억제 또는 치료되었는지를 조직학적으로 밝히지 못했다는 것이며, 향후 이런 실험이 필요할 것으로 생각된다.
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