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문제 정의
- 담죽엽 추출물이 혈관 조직 내 cGMP의 생성량에 영향을 미치는 지를 관찰하기 위하여 실험을 진행하였다. Invitro에서 담죽엽 추출물을 흉부대 동맥에 직접 투여한 후 흉부대동맥에서 125I을 이 용한 방사면역 분석법 (radioimmunoassay, RIA)을 통하여 cGMP 생성량을 측정하였다.
- 그러나 담죽엽 추출물을 이용한 혈관 이완효과와 그 작용기전은 아직까지 밝혀진 바가 없다. 따라서 이 실험에서는 Phenylephrine(PE)전 처리로 수축시킨 백서의 흉부 대동맥에서 담죽엽 추출물을 이용하여 혈관 이완효과와 그 작용기전을 밝히고자 한다.
- 본 연구는 담죽엽 추출물의 혈관이완 효과 및 그 작용 기전을 추정하였다. 담죽엽 추출물은 내피 세포 의존적으로 혈관 평활근을 이완시켰고, 이와 같은 효과는 용량 의존적으로 나타났으며, NO/cGMP 신호 전달계를 차단하면 완전히 억제되었다.
- 이에 본 연구에서는 전통생약의 효능을 과학적으로 검정하고 나아가 천연물로부터 고혈압 치료제의 개발 가능성을 탐색하기 위해 담죽엽 추출물에 대하여 쥐의 흉부대동맥 혈관을 이용한 혈관이완 효과를 검토하였다.
제안 방법
- 담죽엽 추출물이 혈관 조직 내 cGMP의 생성량에 영향을 미치는 지를 관찰하기 위하여 실험을 진행하였다. Invitro에서 담죽엽 추출물을 흉부대 동맥에 직접 투여한 후 흉부대동맥에서 125I을 이 용한 방사면역 분석법 (radioimmunoassay, RIA)을 통하여 cGMP 생성량을 측정하였다. 그 결과, 담죽엽 추출물을 투여하지 않은 군에 비해 투여한 군은 농도 의존적으로 cGMP를 생성량이 증가함을 확인 할 수 있었다.
- PE (1×10-6 M)으로 수축을 유도하였으며, ACh에 의한 반응은 이전의 연구에서 알려진 바와 같이 내피 의존적 이여서15),이를 통한 내피세포의 유무를 확인 한 후 실험을 진행하였다.
- 건강한 Sprague-Dawley백서 (몸무게 약 250- 300g)의 두부를 탈골시킨 후 흉곽을 절제하고 흉부 대동맥을 분리하였다. 신속하게 분리된 흉부 대동맥을 95% O2와 5% CO2의 혼합기체로 포화된 ice-coldKrebs용액 (pH 7.
- 따라서 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과와 여러 다양한 혈관활성 인자들과의 연관성 및 그 기전을 알아보기 위하여 자율신경계 차단, 칼슘 및 칼륨 이온통로의 억제, cycloosygenase (COX)의 억제, NO 생성 차단과 같은 방법을 이 용하였다. 내피세포 유래 혈관 이완 인자의 본체인 NO가 담죽엽의 혈관 이완에 관여하는지를 알 아보고자 먼저 NO 합성 억제제인 L-NAME를 전 처리한 후 측정하였다. 그 결과, 담죽엽의 혈관 이완 효과가 현저히 차단되었다.
- 담죽엽 추출물에 의한 혈관 이완 효과가 자율 신경계 수용체와의 연관성을 알아보기 위하여 비 선택성 교감신경 β 수용체 차단제인 propranolol (1×10-6 M,non-selectiveblockerofβ-adrenoceptor), 부교감 신경 수용체 차단제인 atropine(1×10-6 M, muscarinicreceptorblocker)을 각각 전 처리한 후 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과를 측정하였다.
- 담죽엽 추출물에 의한 혈관 이완 효과의 또 다른 기전인 cGMP와 관련이 있는지를 확인하기 위하여 세포질 guanylylcyclase억제제(solubleguanylyl cyclase,sGC,inhibitor)인 ODQ (1×10-6 M)를 전 처리한 후 담죽엽 추출물을 용량 의존적으로 처리하여 혈관 이완 효과를 관찰 하였다.
- 담죽엽 추출물의 혈관 이완 기전을 알아보기 위하여 여러 가지 약물들을 이용하여 혈관 이완효과 변화를 측정하였다. 먼저 이들 약물을 organ chamber에 20분간 전 처리한 후 PE으로 수축시켰고, 이어서 담죽엽 추출물에 의한 이완반응을 용량 의존적으로 관찰하였다.
- 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과가 혈관내피세포 유래 산화 질소계 nitricoxide(NO)생성과 관련이 알아보기 위하여 비 특이적인 nitricoxide synthesis억제제 (non-selectivenitricoxidesynthesis, NOS, inhibitor)인 L-NAME (1×10-5 M)을 전 처리하고 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과를 관찰하 였다.
- 담죽엽 추출물이 어떠한 기전을 통하여 이완효과를 보이는지 알아 보기 위하여 여러 가지 방법을 통하여 실험을 진행하였다. 먼저 담죽엽 추출물이 내피세포 의존적인지 알아보기 위해 Krebs 용액에서 유지된 백서 흉부대동맥 절편을 물리적인 방법을 이용하여 내피 세포를 제거(-endothelium)하였다.
- 혈관 평활근의 이완은 혈관 내피세포에 존재하는 수용체나 소기관들에 의해 분비되는 여러 종류의 혈관 활성 인자(vasoactivefactor)에 의해 조절되는데, 이러한 혈관활성 인자에는 nitric oxide (NO, EDRF, Endothelium-derived relaxingfactor)prostacyclin (PGI2), 내피세포 유래 과분극 인자 (EDHF, endothelium-derived hyper-polarizingfactor) 등이 알려져 있다17). 따라서 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과와 여러 다양한 혈관활성 인자들과의 연관성 및 그 기전을 알아보기 위하여 자율신경계 차단, 칼슘 및 칼륨 이온통로의 억제, cycloosygenase (COX)의 억제, NO 생성 차단과 같은 방법을 이 용하였다. 내피세포 유래 혈관 이완 인자의 본체인 NO가 담죽엽의 혈관 이완에 관여하는지를 알 아보고자 먼저 NO 합성 억제제인 L-NAME를 전 처리한 후 측정하였다.
- 담죽엽 추출물이 어떠한 기전을 통하여 이완효과를 보이는지 알아 보기 위하여 여러 가지 방법을 통하여 실험을 진행하였다. 먼저 담죽엽 추출물이 내피세포 의존적인지 알아보기 위해 Krebs 용액에서 유지된 백서 흉부대동맥 절편을 물리적인 방법을 이용하여 내피 세포를 제거(-endothelium)하였다. PE (1×10-6 M)으로 수축을 유도하였으며, ACh에 의한 반응은 이전의 연구에서 알려진 바와 같이 내피 의존적 이여서15),이를 통한 내피세포의 유무를 확인 한 후 실험을 진행하였다.
- 담죽엽 추출물의 혈관 이완 기전을 알아보기 위하여 여러 가지 약물들을 이용하여 혈관 이완효과 변화를 측정하였다. 먼저 이들 약물을 organ chamber에 20분간 전 처리한 후 PE으로 수축시켰고, 이어서 담죽엽 추출물에 의한 이완반응을 용량 의존적으로 관찰하였다. 혈관 내피세포 비의존형 실험을 수행할 때에는 혈관 내피 세포를 물리적은 방법으로 제거하였으며, PE 수축과 ACh이완 반응으로 혈관 내피 세포의 제거를 확인 후 실험을 수행하였다.
- 목적에 따라 혈관 내에 200μm의 steel을 집어넣어 물리적인 방법으로 혈관 내피 세포를 제거하였다.
- 혈관 조직은 바로 액체 질소에 넣어 반응을 정지시킨 후 -70℃에 보관한 후 cGMP (cyclic guanosin-3,5, -monophosphate)농도 측정에 이용하였다. 무게를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid(TCA)존재 하에서 균질화 시킨 후 13,000g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상층액을 물이 포화된 diethylether를 이용하여 3회 추출하였다. 추출액은 Speed-vac농축기를 이용하여 농축하고 cGMP 측정은 125I을 이용한 방사면역 분석법 (radioimmunoassay, RIA)을 이용하여 측정하였다14).
- 백서의 흉부대동맥의 이완 반응은 먼저 1×10-6 M의 phenylephrine(PE)으로 수축시킨 후 평형에 도달하였을 때 1×10-6 M의 acetylcholine (ACh)에 의한 이완 반응을 관찰하였다.
- 백서의 흉부대동맥의 이완 반응은 먼저 1×10-6 M의 phenylephrine(PE)으로 수축시킨 후 평형에 도달하였을 때 1×10-6 M의 acetylcholine (ACh)에 의한 이완 반응을 관찰하였다. 본 논문에서 사용한 모든 실험은 ACh을 통한 혈관 내피 세포의 안전성을 확보한 후 실시하였다.
- 이때 heat/ circulator(ModelCW-10GL,JEIO TECH,Korea)에 의해 일정한 온도를 유지하였다. 본 실험을 시작하기 전에 90분 동안 방치하여 평형상태에 도달하게 하였는데, 초기 60분간 점진적으로 tension을 증가시켜 1g의 optimum tension에 도달하도록 하였다. 백서의 흉부대동맥의 이완 반응은 먼저 1×10-6 M의 phenylephrine(PE)으로 수축시킨 후 평형에 도달하였을 때 1×10-6 M의 acetylcholine (ACh)에 의한 이완 반응을 관찰하였다.
- 본 연구는 담죽엽 추출물(Lophatherum gracile Brongn, ELB)이 백서의 흉부 대동맥에서 α -adrenaline 수용체를 선택적으로 흥분시킴으로써 혈관을 수축시키는 약물인 phenylephrine (PE)에 의한 혈관 수축을 용량 의존적으로 현저하게 이완시켰다.
- 건강한 Sprague-Dawley백서 (몸무게 약 250- 300g)의 두부를 탈골시킨 후 흉곽을 절제하고 흉부 대동맥을 분리하였다. 신속하게 분리된 흉부 대동맥을 95% O2와 5% CO2의 혼합기체로 포화된 ice-coldKrebs용액 (pH 7.4)에 넣고 내부의 혈액과 혈관 주위 지방 및 결합조직을 제거한 후 약 3mm의 길이의 절편으로 만들었다. 이때 혈관 내피세포의 보존을 위해 혈관 내벽을 손상시키지 않도록 신중을 기하였다.
- 준비 되어진 흉부 대동맥 절편은 orgam chamber 안 95% O2, 5% CO2 혼합가스로 포화시킨 37.4℃의 Krebs 용액에서 고정시킨 후 isometric tension을 force-displacementtransducer(GrassFT 03,GRASSInstrument,MA,USA)가 장착된 생리 기록계 (GrassModel7E,GrassInstrument, MA,USA)를 이용하여 측정하였다. 이때 heat/ circulator(ModelCW-10GL,JEIO TECH,Korea)에 의해 일정한 온도를 유지하였다.
- 특히 L형 Ca2+ 통로 (L-typeCa2+ channel)가 평활근에 가장 많은 형태로서, L형 Ca2+ 통로 차단이 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과에 미치는 영향을 측정하기 위하여 L형 Ca2+ 통로 차단제인 verapamil과 diltiazem (1×10-6 M,L-typeCa2+ channelblocker)을 전 처리한 후 담죽엽 추출물에 의한 혈관이완 정도를 측정하였다.
- 항체와 결합한 125I-cGMP와 비 결합형 125I--cGMP 은 charcoal을 이용하여 분리하였으며 ϒ-카운터를 이용하여 방사능을 측정하였다.
- 먼저 이들 약물을 organ chamber에 20분간 전 처리한 후 PE으로 수축시켰고, 이어서 담죽엽 추출물에 의한 이완반응을 용량 의존적으로 관찰하였다. 혈관 내피세포 비의존형 실험을 수행할 때에는 혈관 내피 세포를 물리적은 방법으로 제거하였으며, PE 수축과 ACh이완 반응으로 혈관 내피 세포의 제거를 확인 후 실험을 수행하였다.이후에는 Krebs용액으로 3회 세척하고 다음 실험을 수행하였다.
- 혈관 평활근의 정상적인 생리활성 유지를 위해 Krebs용액 (Krebs-HenseleitSolution)을 사용하였으며, 그 조성은 118mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.1mM MgSO4, 1.2mM KH2PO4, 1.5mM CaCl2, 25mM NaHCO3, 10mM glucose이고,pH는 7.4로 보정하였다.
대상 데이터
- 이 연구에 사용된 acetylcholine(ACh), phenylephrine HCl(PE), N G-nitroargininemethylester(L-NAME), 1H-[1,2,4]-oxadiazole-[4,3-α]-quinoxalin-1-one (ODQ), indomethacin, tetra-ethylammonium (TEA), glibenclamide, verapamil,atropine,propranolol등은 SigmaChemicalCo.
데이터처리
- 실험 결과의 유의성은 실험 결과를 Students t-test 나 one-way ANOVA test를 통하여 p가 0.05이하인 경우 유의한 차이로 판정하였다.
이론/모형
- 무게를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid(TCA)존재 하에서 균질화 시킨 후 13,000g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상층액을 물이 포화된 diethylether를 이용하여 3회 추출하였다. 추출액은 Speed-vac농축기를 이용하여 농축하고 cGMP 측정은 125I을 이용한 방사면역 분석법 (radioimmunoassay, RIA)을 이용하여 측정하였다14). 간단히 설명하면, 시료와 표준물질을 50mM sodium acetate완충용액 (pH 4.
성능/효과
- 그러므로 NO/cGMP계의 회복을 통한 혈관이완활성의 증가는 심혈관계 질환을 치료하는데 있어 중요한 의미를 지닌다. NO/cGMP계가 담죽엽에 의한 혈관 이완 효과에 관여한다면 NO에 의하여 활성화 되는 가용성 구아닐산 고리화효소 또한 담죽엽에 의한 혈관 이완 효과에 관여할 것으로 사료되어 가용성 구아닐산 고리화 효소 억제제인 ODQ를 전 처리 한 후 혈관이완 효과를 측정한 결과, 담죽엽에 의한 혈관 이완 효과가 억제되었다. 따라서 담죽엽에 의한 혈관 이완 효과는 NO/cGMP계를 경유하여 일어나는 것을 의미한다.
- 특히 L형 Ca2+ 통로 (L-typeCa2+ channel)가 평활근에 가장 많은 형태로서, L형 Ca2+ 통로 차단이 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과에 미치는 영향을 측정하기 위하여 L형 Ca2+ 통로 차단제인 verapamil과 diltiazem (1×10-6 M,L-typeCa2+ channelblocker)을 전 처리한 후 담죽엽 추출물에 의한 혈관이완 정도를 측정하였다. 그 결과 verapamil과 ditiazem은 담죽엽 추출물의 혈관이완 이완 효과에 영향을 주지 못하였다(Fig. 6).
- M)를 전 처리한 후 담죽엽 추출물을 용량 의존적으로 처리하여 혈관 이완 효과를 관찰 하였다.그 결과 담 죽엽 추출물의 혈관 이완 효과가 완전히 억제됨을 관찰 할 수 있었다(Fig. 2).
- M)을 전 처리하고 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과를 관찰하 였다. 그 결과, 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과는 L-NAME에 의해 현저히 억제됨을 관찰 할 수 있었다(Fig. 2).
- 내피세포 유래 혈관 이완 인자의 본체인 NO가 담죽엽의 혈관 이완에 관여하는지를 알 아보고자 먼저 NO 합성 억제제인 L-NAME를 전 처리한 후 측정하였다. 그 결과, 담죽엽의 혈관 이완 효과가 현저히 차단되었다.
- 그 결과, 담죽엽 추출물을 투여하지 않은 군에 비해 투여한 군은 농도 의존적으로 cGMP를 생성량이 증가함을 확인 할 수 있었다.
- PE (1×10-6 M)으로 수축을 유도하였으며, ACh에 의한 반응은 이전의 연구에서 알려진 바와 같이 내피 의존적 이여서15),이를 통한 내피세포의 유무를 확인 한 후 실험을 진행하였다. 내피세포의 유무가 확인되어진 혈관에 담죽엽 추출물을 용량 의존적으로 처리하여 혈관 이완 효과를 측정한 결과, 내피 세포가 존재 하지 않을 경우 혈관 이완 효과는 결과 1과 비교하였을 때 현저하게 억제 되었음을 관찰 할 수 있었다(Fig. 1).
- 담죽엽 추출물에 의한 혈관 이완효과가 cycloosygenase (COX)의 활성에 따른 prostacyclin (PGI2)의 생성과의 연관성을 관찰하기 위하여 비 선택성 COX 억제제 (non-selectiveCOX inhibitor)인 indomethacin (1×10-5 M)전처리 후 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과를 측정한 결과, indomethacin 전 처리 하지 않은 군과 유의한 차이가 없었다 (Fig. 3).
- 본 연구는 담죽엽 추출물의 혈관이완 효과 및 그 작용 기전을 추정하였다. 담죽엽 추출물은 내피 세포 의존적으로 혈관 평활근을 이완시켰고, 이와 같은 효과는 용량 의존적으로 나타났으며, NO/cGMP 신호 전달계를 차단하면 완전히 억제되었다. 더욱이 혈관 조직을 담죽엽 추출물과 반응 시키면 cGMP의 생성이 증가하였고, 이러한 증가는 혈관 내피세포의 제거나 NO 합성효소나 세포질 구아닐산 고리화 효소 차단 시 나타나지 않았다.
- K+통로에 대한 억제제로는 KCa을 차단하는 TEA와 sulfonylurea계 약물인 glibenclamide로 후자는 혈관 평활근에서 KCa 통로에는 영향을 미치지 않고 KATP 만을 차단한다. 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과가 KCa 또는 KATP를 경유하여 일어나는지 알아보기 위하여 KCa 차단제인 TEA와 KATP 차단제인 glibenclamide를 전 처리한 후 혈관 이완 효과를 측정한 결과, 담죽엽 추출물은 혈관 이완 효과는 유의한 차이를 보였다. 따라서 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과에 K+ 통로 중 KATP로 영향을 주고 있는 것으로 사료된24).
- PGI2은 arachidonic acid로부터 COX에 의하여 생성되고, 이 때 생성된 PGI2은 혈관 이완 작용을 갖는다. 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과가 PGI2의 생성과 관련이 있는지를 알아보기 위하여 COX 억제제인 indomethacin을 전 처리하고 담죽엽의 이완 효과를 측정한 결과 indomethacin을 전 처리하지 않은 군과 비교하여 차이가 없었다.이와 같은 결과로 볼 때 PGI2은 담죽엽 추출물의 혈관 이완 작용과는 무관한 것으로 사료된다20,21).
- 담죽엽 추출물이 백서의 혈관 평활근에 미치는 영향을 관찰 하기 위하여 PE (1×10-6 M)으로 수축한 후 담죽엽 추출물을 투여하여 혈관 이완효과를 측정한 결과, 혈관은 용량 의존적으로 이완되어짐을 관찰 할 수 있었다(Fig. 1).
- 이에 따라 말초 저항이 감소하고 혈압이 떨어진다. 담죽엽의 혈관 이완 효과가 L-typeCa2+ 통로와 연관이 있는지 알아보기 위하여 L-type Ca2+ 통로 차단제인 verapamil과 diltiazem을 전 처리 한 후 혈관 이완 효과를 측정한 결과, verapamil과 diltiazem은 담죽 엽의 혈관 이완효과는 차단되지 않았다. 따라서 이와 같은 결과로 볼 때, 담죽엽에 의한 혈관 이완에 L-형 Ca2+ 통로는 관여하지 않는 것으로 사료된다.
- 더욱이 혈관 조직을 담죽엽 추출물과 반응 시키면 cGMP의 생성이 증가하였고, 이러한 증가는 혈관 내피세포의 제거나 NO 합성효소나 세포질 구아닐산 고리화 효소 차단 시 나타나지 않았다. 또한 K+ 통로 차단함으로 인해 이완효과에 영향을 받는 것으로 나타났다. 그러나 담죽엽 추출물의 혈관 이완효과는 PGI2 생성 차단이나, Ca2+ 통로 차단 등에 의해서는 영향을 받지 않았다.
- 이러한 NO는 세포질의 solubleguanylylcyclase(sGC)를 활성화 시켜 cGMP의 생성을 증가시켜 신호 전달 체계를 통해 혈관 평활근을 이완 시킨다19). 본 연구에서 L-NAME의 전 처리에 의해 담죽엽의 이완 효과가 현저히 억제되는 것으로 보아 담죽엽에 의한 혈관 이완 효과는 산화질소계를 경유하여 일어나는 것으로 사료된다.
- 분비된 NO는 sGC를 활성화 시켜 cGMP 생성을 촉진 하게 한게 되는데, 이를 비 특이적 NO 억제제인 L-NAME (1×10-5 M)와 GC 억제제인 ODQ (1×10-5 M)를 전처리 한 후 담죽엽 추출물의 cGMP 생성량을 측정해 본 결과, 담죽엽 추출물을 단독으로 처리한 군에 비하여 전처리 한 군에서 cGMP의 생성량이 유의한 차이를 보였다(Fig. 7).
- 이 연구에서는 담죽엽 추출물이 자율 신경계 수용체를 경유하여 혈관을 이완시키는지 여부를 알아보기 위하여 콜린성 수용체 중에서 무스카린성 수용체를 선택적으로 차단하는 atropine과 β 수용체를 선택적으로 차단하는 항 아드레날린성 약물인 propranolol을 전 처리한 결과, 담죽엽의 혈관이완 효과는 항 아드레날린성 약물인 propranolol을 전 처리하였을 시에는 영향을 받지 않았으나, atropine을 전 처리하였을 혈관이완의 정도에는 부분적으로 유의한 차이를 보였지만 완전히 억제되지는 않았다.
- 이와 같은 결과로 볼 때, 담죽엽 추출물의 혈관 평활근 이완 기전은 내피세포에서의 NO/cGMP 경로 및 K+ 통로를 활성화 시켜 나타나는 것으로 사료된다.
- 평활근 세포의 안정막 전압 유지에 관여하여 평활근 세포에 중요한 역할을 하는 전압 의존성 K+ 통로(potassium channel)가 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과에 영향을 주는지를 측정하기 위하여 비 선택적 K+ 통로 억제제인 TEA (1×10-5 M, non-selective channelK+ blocker)와ATP-감수성 K+ 통로 차단제인 glibenclamide(1×10-5 M,ATP -sensitiveK+ channelblocker)를 전 처리한 결과 담죽엽 추출물의 혈관 이완 효과에 유의적인 차이를 보여주었다(Fig. 5).
후속연구
- 이상의 결과를 종합하여 보면 담죽엽 추출물은 NO/cGMP계를 활성화시킴으로써 혈관이완효과를 가지고 있음을 제시 할 수 있으며, 이러한 결과는 심혈관계 질환에 유용하게 사용될 수 있는 가능성을 제시하였으며 동물모델을 이용한 연구에 유용한 정보를 제시해 준다.
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