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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완 효과와 그 이완 기전을 규명하고자 한다.
- 본 연구에서는 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과를 검증하기 위하여 내피가 온전한 혈관에 phenylephrine으로 수축을 유도한 후 농도를 달리하여 장미근 메탄올 추출물을 첨가하여 혈관 이완작용을 관찰하였다. 그 결과, 장미근 메탄올 추출물은 농도 의존적으로 혈관 평활근을 이완시켰다.
- 이러한 혈관 활성물질에는 혈관 평활근을 이완시키는 물질인 EDRF, prostacyclin, EDHF가 있으며11), 수축시키는 물질로는 endothelin, 내피세포유래 수축인자(endothelium-derived contracting factor, EDCF) 가있다. 이러한 연구보고와 선행된 결과를 근거로 장미근 메탄올추출물의 내피세포 의존적 혈관 이완효과에 어떤 내피세포 유래혈관 이완인자가 작용하는지를 조사하였다.
제안 방법
- , San Diego, CA, USA) 와 1251 가 결합된 cGMP (10000 cpm per 100 pl, specific activity 2200 ci Mm, Dupont-New England Nuclear, Wilmington, DE, USA)를 함께 넣은 후 4℃에서 24시간 반응시켰다. 결합형과 비결합형은 charcoal을 이용하여 분리하였으며 Y -counter를 이용하여 방사능을 측정하였다.
- 혈관 조직은 바로 액체질소에 넣어 반응을정지시킨 후 -76℃에 보관한 후 cGMP의 농도를 측정하였다. 무게 (wet weight)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid 존재하에서 균질화시킨 후 13, 000 g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 물이 포화된 diethylether를 이용하여 4회 추출하였다. 추출액은 Speed-vac 농축기를 이용하여 농축하고 cGMP의측정은 방사면역 분석법을 이용하여 분석하였다.
- 이완률은 phenylephrine에 의한 수축에 대해 백분율로 계산하였다. 약물 실험을 하기전 흉부 대동맥 절편에 1 g의 기저 긴장도를 부하하고, 10분 간격으로 Krebs 용액을 갈아주면서 90분간 평형을 유지시켰다. 일정한 기저선이 유지되면 1 X 10'5 6 M의 phenylephrine으로 수축시키고 5 분후 1 X 106 M의 acetylcholine (ACh) 로 이완시켜 이완률이 90%이상이었을 경우 혈관 내피세포가 손상받지 않은 것으로 판정하였다.
- 그 후 Krebs 용액으로 3회 세척하고 실험을 수행하였다. 여러가지 약물들에 의한 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완 효과의 변화 즉정은 약물을 20분간 전처리하고 phenylephrine으로 수축시킨 후, 장미근 메탄올 추출물에 의한 이완반응을 농도 의존적으로 관찰하는 방법으로 측정하였다. 혈관 내피세포 비의존형 실험을 시행할 때에는 혈관 내피세포를 작은 면봉을 사용하여 제거한 후, phenylephrine으로 수축시키고 ACh으로 이완 시켜 혈관 내피세포의 제거를 확인.
- 이용하여 측정하였다. 이완률은 phenylephrine에 의한 수축에 대해 백분율로 계산하였다. 약물 실험을 하기전 흉부 대동맥 절편에 1 g의 기저 긴장도를 부하하고, 10분 간격으로 Krebs 용액을 갈아주면서 90분간 평형을 유지시켰다.
- 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과가 sGC의 활성화와 관련이 있는지를 알아보기 위하여 세포질 sGC 억제제인 ODQ 1 X 10-6 M을 전처리한 후 혈관 이완효과를 측정하였다. 그 결과, 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과가 완전히 억제되었다(Fig.
- 또한, 혈관 내피세포와 평활근세포 모두 β-수용체가 존재하는데, 혈관 평활근세포에서 6수용체 효능제가 결합하면 adenylate cyclase가 활성화되어 세포 내 cAMP 농도를 증가시켜 이완 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다23, 저). 장미근 메탄올추출물이 자율신경계의 수용체를 경유하여 혈관을 이완시키는지 여부를 알아보기 위하여, 콜린성 수용체 중에서 무스카린성 수용체를 선택적으로 차단하는 atropine을 전처리한 후 혈관 이완 정도를 관찰하였다. 그 결과, 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과는 atropine을 전처리한 군과 전 처리하지 않은 군 사이에 아무런 차이가 없었다.
- 1 x 10-6 M의 phenylephrine을 넣어 10분간 더 평형을 유지시킨 후 농도별로 장미근 메탄올 추출물 (3 X 10t 1 X 10t 3 x 104 g/ml)과 함께 3분간 반응시켰다. 혈관 조직은 바로 액체질소에 넣어 반응을정지시킨 후 -76℃에 보관한 후 cGMP의 농도를 측정하였다. 무게 (wet weight)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid 존재하에서 균질화시킨 후 13, 000 g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 물이 포화된 diethylether를 이용하여 4회 추출하였다.
- 흉부 대동맥 절편을 95% 65% CO2 기체로 포화시킨 37℃의 Krebs 용액이 들어있는 organ bath의 저부에 한쪽 끝을 고정시키고, 다른 쪽 끝은 force-displacement transducer (Grass FT 03, GRASS Instrument, MA, USA)에 연결하여 고정시킨 후 isometric tension을 생리 기록계 (Grass Model 7E, Grass Instrument, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 이완률은 phenylephrine에 의한 수축에 대해 백분율로 계산하였다.
대상 데이터
- 몸무게 약 250-300 g의 건강한 수컷 Sprague-Dawley계 백서를 사용하였다. 경추를 탈골시켜 희생시킨 후, 즉시 복강을 열고 흉부 대동맥을 분리하였다.
- 이 연구에 사용된 ACh, phenylephrine, HQZ NG-nitroarginine methyl ester (L-NAME), lH-tlee-oxadiazole-eS-aJ-quinoxalin-l-one (ODQ), indomethacin/ glibenclamide, tetraethylammonium (TEA), verapamil, diltiazem, atropine, propranolol 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)으로부터 구입하여 사용하였다.
- 혈관.평활근의 정상적인 생리활성 유지를 위해 Krebs 용액 (Krebs-Henseleit Solution)을 사용하였으며/ 그 조성은 118 mM Nad, 4.7 mM Kd, 1.1 mM MgSO% 1.2 mM KHPO4, 1.5 mM CaQe 25 mM NaHCO3/ 10 mM glucose이고, pH는 7.4로 보정하였다.
- 혈관 EDRF의 본체인 NO는 내피세포의 L-arginine으로부터 NQS에 의하여 합성 . 분비되어 혈관 평활근으로 확산 된다0 NOS는 3가지의 유형이 있는데, 첫 번째 유형은 뇌형 산화질소합성 효소 (bNOS, nNOS, NOS I)로 뇌 조직에서 처음 발견되었고 주로 신경 전달 물질로서의 NO를 합성하는 역할을 하고 있다.
데이터처리
- 실험 결과의 유의성 검증은 Sigma Plot 2000 프로그램을 이용하여 처리하였으며, 실험결과를 Students t-test나 one-way ANOVA test를 통하여 p가 0.05 이하인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 무게 (wet weight)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid 존재하에서 균질화시킨 후 13, 000 g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 물이 포화된 diethylether를 이용하여 4회 추출하였다. 추출액은 Speed-vac 농축기를 이용하여 농축하고 cGMP의측정은 방사면역 분석법을 이용하여 분석하였다. 간단히설명하면, 시료와 표준물질을 50 mM sodium acetate 완충용액 (pH 48)에 최종 용적이 100 μ1가 되게 첨가한 후 100 μ1의 희석된 cGMP 항체 (Calbiochem-Novabiochem, Co.
성능/효과
- Ca2+ 통로 차단이 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 L-type Ca2+ 통로 차단제인 1 X IO-6 M verapamil과 1 x IO-5 M dilteazem을 각각 전 처리한후 장미근 메탄올 추출물에 의한 이완정도를 측정한 결과, 전 처리하지 않은 군과 유의한 차이가 없었다(Fig. 5).
- K+ 통로 차단이 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완 효과에 영향을 주는지를 알아보기 위하여 ATP-sensitive K* 통로 (KATP) 억제제인 1 X IO-6 M glibenclamide 와 비 선택적 K+ 통로 억제제인 1 X 10-4 M TEA를 전처리한 결과, 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과에 영향을 주지 않았다(Fig. 6).
- NO가 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과에 관여한다면 NO에 의하여 활성화되는 sGC 또한 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과에 관여할 것으로 사료되어 sGC 억제제인 ODQ를 전처리한 후 혈관 이완효과를 측정한 결과, 혈관 이완효과는 현저히 억제되었다. 이러한 결과는 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과가 NO/cGMP 신호전달계를 경유하여일어날 수 있음을 시사한다.
- 또한, 평활근 세포 내 Ca2+ 농도를 증가시키는 여러 경로들을 억제시켜 Ca2+ 농도가 저하되면 혈관 평활근이 이완하게 된다14). NO가 장미근메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과에 관여하는지를 알아보기위하여 eNOS 억제제인 L-NAME를 전 처리한 후 이완효과를 측정한 결과, 혈관 이완효과가 억제되었다. 이는 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완작용에 내피세포 유래 NO가 관여함을 시사하는 것이다.
- Prostacyclin이 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과에 영향을 미치는지를 판단하기 위하여 비 선택성 COX 활성 억제제인 indomethacin을 1 x 10'5 M로 전처리 하에서 장미근 메탄올추출물의 혈관 이완효과를 측정한 결과, indomethacin을 전처리하지 않은 군과 유의한 차이가 없었다(Fig. 3).
- 장미근 메탄올추출물이 자율신경계의 수용체를 경유하여 혈관을 이완시키는지 여부를 알아보기 위하여, 콜린성 수용체 중에서 무스카린성 수용체를 선택적으로 차단하는 atropine을 전처리한 후 혈관 이완 정도를 관찰하였다. 그 결과, 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과는 atropine을 전처리한 군과 전 처리하지 않은 군 사이에 아무런 차이가 없었다. 다음으로 아드레날린성 수용체를 비 선택적으로 차단하는 항 아드레날린성 약물인 propranolol을 전 처리한 결과 마찬가지로 전 처리하지 않은 군과 비교하여 차이가 없었다.
- 이완작용을 관찰하였다. 그 결과, 장미근 메탄올 추출물은 농도 의존적으로 혈관 평활근을 이완시켰다. 또한, 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과의 내피세포 의존성을 확인하기 위해 혈관 내피세포를 제거한 후 혈관 이완효과를 측정하였으나장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과는 전혀 관찰되지 않았다.
- 10-6 M을 전처리한 후 혈관 이완효과를 측정하였다. 그 결과, 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과가 완전히 억제되었다(Fig. 2).
- 내피세포가 온전한 혈관 절편을 phenylephrine (1 x 10'6 M) 으로 수축시킨 후 장미근 메탄올 추출물의 농도를 달리하여 혈관 이완효과를 측정한 결과, 농도 의존적으로 이완되었으며 1 X 10』g/ml의 장미근 메탄올 추출물 농도에서는 87.26 ±0.27% 이완효과를 관찰할 수 있었다. 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과가 혈관 내피세포 의존적인지를 밝히기 위하여 혈관 내피세포를 제거한 후 혈관 이완효과를 측정한 결과, 거의 완벽하게 혈관 이완효과가 억제되었다(Fig.
- 이러한 결과는 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과가 NO/cGMP 신호전달계를 경유하여일어날 수 있음을 시사한다. 또한 장미근 메탄올 추출물을 혈관절편에 투여하고 혈관절편에서 생성된 cGMP량을 측정한 결과, 장미근 메탄올 추출물을 투여한 혈관 절편에서 cGMP 증가를 확인할 수 있었다. 이러한 결과들로 볼 때, 장미근 메탄올 추출물은혈관 내피세포에서 NO의 합성을 증가시키고 평활근 세포내에서세포질의 sGC를 활성화시켜 cGMP의 생성을 증가시켜 혈관을이완시키는 것으로 사료 된다.
- 그 결과, 장미근 메탄올 추출물은 농도 의존적으로 혈관 평활근을 이완시켰다. 또한, 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과의 내피세포 의존성을 확인하기 위해 혈관 내피세포를 제거한 후 혈관 이완효과를 측정하였으나장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과는 전혀 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완 효과는 혈관 내피세포 의존적임을 시사한다.
- 10). 본 연구결과 혈관 이완 효과가 뚜렷한 것으로 보아 장미근은 혈관 이완을 통하여 혈액 순환을 촉진하고 심혈관 질환을 억제하는 것으로 사료된다.
- 5g 얻어 실험에 이용하였다. 시료는 25% dimethylsulfoxide (DMSO)에 녹였으며, 최종 DMSO 농도인 0.25%는 혈관이완에 영향을 미치지 않음을 확인하였다
- 또한 장미근 메탄올 추출물을 혈관절편에 투여하고 혈관절편에서 생성된 cGMP량을 측정한 결과, 장미근 메탄올 추출물을 투여한 혈관 절편에서 cGMP 증가를 확인할 수 있었다. 이러한 결과들로 볼 때, 장미근 메탄올 추출물은혈관 내피세포에서 NO의 합성을 증가시키고 평활근 세포내에서세포질의 sGC를 활성화시켜 cGMP의 생성을 증가시켜 혈관을이완시키는 것으로 사료 된다.
- 또한, 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과의 내피세포 의존성을 확인하기 위해 혈관 내피세포를 제거한 후 혈관 이완효과를 측정하였으나장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과는 전혀 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완 효과는 혈관 내피세포 의존적임을 시사한다.
- 이상의 결과를 요약하면, 장미근 메탄올 추출물은 혈관내피세포 의존적으로 혈관 평활근을 이완시키며, NO/cGMP 신호기전이 장미근에 의한 혈관 이완에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
- 또한, 무스카린성 수용체 차단 및아드레날린성 수용체 차단제 등에 의해서도 영향을 받지 않았다. 이와 같은 결과로 볼 때, 장미근 메탄올 추출물의 혈관 평활근 이완 기전은 내피세포에서의 NO/cGMP 경로를 활성화 시켜 나타나는 것으로 사료된다.
- 약물 실험을 하기전 흉부 대동맥 절편에 1 g의 기저 긴장도를 부하하고, 10분 간격으로 Krebs 용액을 갈아주면서 90분간 평형을 유지시켰다. 일정한 기저선이 유지되면 1 X 10'5 6 M의 phenylephrine으로 수축시키고 5 분후 1 X 106 M의 acetylcholine (ACh) 로 이완시켜 이완률이 90%이상이었을 경우 혈관 내피세포가 손상받지 않은 것으로 판정하였다. 그 후 Krebs 용액으로 3회 세척하고 실험을 수행하였다.
- 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과와 자율신경계와의 연관성을 알아보기 위하여 비선택성 β-아드레날린성 수용체 차단제인 propranolol을 1 x 10'6 M, 항 무스카린성 약물인 atropine을 1 x IO'6 M로 각각 전 처리한 후 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과를 측정한 결과, 약물을 처리하지 않은 군과 비교하여 혈관 이완효과의 유의한 차이가 없었다(Fig. 4).
- 장미근 메탄올 추출물은 내피세포 의존적으로 혈관 평활근을 이완시켰고, 이와 같은 효과는 농도 의존적으로 나타났으며, NO/cGMP 신호전달계를 차단하면 완전히 억제되었다. 더욱이 혈관 조직을 장미근 메탄올 추출물과 반응시키면cGMP의 생성이 증가하였고, 이러한 증가는 혈관 내피세포의 제거나 NOS나 sGC 차단에 의하여 없어졌다.
- 혈관 평활근에서 K+ 통로로는 KCa, ATP-sensitive K+ 통로 (KATP) 등이 있고, K+ 통로 차단제 중 TEA는 비선택적으로 K+ 통로를 차단하고, sulfonylurea계 약물인 glibenclamide는 KCa 통로에는 영향을 미치지 않고 KATP만을 차단한다. 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완 효과가 EDW와 관련이 있는지를 알아보기 위해, 즉, K* 통로를 경유하여 일어나는지 알아보기 위해 비선택성 K+ 통로 차단제인 TEA와 KATP 차단제인 glibenclamide를 전 처리한 후 혈관 이완효과를 측정한 결과, TEA와 glibenclamide를 전 처리하지 않은 대조군과 비교하여 이완 정도의 차이가 없었다. 이러한 결과는 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과는 K* 통로, 즉 EDHF와는 무관함을 시사하는 것이다.
- 이러한 과정을 거쳐 세포 내 Ca2+ 농도가 증가하면 calmodulin과결합하여 MLCK를 조절하며 myosine light chain (MLC)의 인산화를 촉진시켜 평활근을 수축시킨다. 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과가 Ca2+ 통로와 연관이 있는지 알아보기 위하여 L-type Ca2+ 통로 차단제인 verapamil과 diltiazem을 각각 전 처리한 후 혈관 이완효과를 측정한 결과, 전 처리하지 않은 군과차이가 없었다. 이와 같은 결과로 볼 때, Ca2+ 통로는 장미근 메탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과와 무관한 것으로 사료된다.
- 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과가 NO의 생성과 관련이 있는지를 알아보기 위하여 비 특이적인 NOS 억제제인 L-NAME 1 X 10-5 M을 전 처리하고 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과를 측정한 결과, 혈관 이완효과가 완전히 억제되었다(Fig. 2).
- 27% 이완효과를 관찰할 수 있었다. 장미근 메탄올 추출물의 혈관 이완효과가 혈관 내피세포 의존적인지를 밝히기 위하여 혈관 내피세포를 제거한 후 혈관 이완효과를 측정한 결과, 거의 완벽하게 혈관 이완효과가 억제되었다(Fig. 1).
- 장미근 메탄올 추출물이 혈관 조직에서 cGMP의 생성에 영향을 미치는지를 관찰하기 위하여 장미근 메탄올 추출물을 흉부대동맥 절편에 직접 투여한 후 cGMP의 생성량을 측정한 결과, 장미근 메탄올 추출물을 투여하지 않은 군에 비해 장미근 메탄올 추출물을 투여한 군이 농도 의존적으로 cGMP의 생성량을 증가시킴을 관찰할 수 있었다(Fig. 7).
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