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문제 정의
- 24) 또한 6-OHDA는 PC12 세포중에 투여하는 경우 세포독성 작용을 나타내고 있다.25) 따라서 본 연구에서는 상기의 isoquinoline 계열 화합물 중에서 임상에서 번용되고 있는 berberine을 선택하고 세포모델(PC12 세포주) 및 신경퇴행성 질환(파킨슨병)의 동물모델을 이용하여 신경세포 독성에 미치는 영향을 검토하고자 한다. 이는 노령화 및 신경퇴행질환을 가진 노약자의 약물요법과 관련하여 노약자에게 isoquinoline 화합물을 포함한 dopamine 생합성 및 대사에 영향을 주는 물질, 산화 스트레스-유도 물질 등의 천연물을 장기간 투여하는 경우, 질환의 진행 및 약물상호작용의 면에서의 영향을 고찰하기 위한 것이다.
- 다음으로 berberine에 의한 PC12 세포중의 6-OHDA-유도 세포독성 증가작용이 berberine의 장기간 투여에 의한 파킨슨병의 진행과정에 미치는 영향을 검토하였다. 파킨슨병 모델은 6-OHDA(8 µg/2 µl, 2 주간)을 뇌실내 흑질부위 투여에 의하여 작성하였고, berberine(5 mg/kg 및 30 mg/kg, 3주간)은 파킨슨병 모델 동물(2 주간 6-OHDA 투여 동물)에 투여하였다.
- 25) 따라서 본 연구에서는 상기의 isoquinoline 계열 화합물 중에서 임상에서 번용되고 있는 berberine을 선택하고 세포모델(PC12 세포주) 및 신경퇴행성 질환(파킨슨병)의 동물모델을 이용하여 신경세포 독성에 미치는 영향을 검토하고자 한다. 이는 노령화 및 신경퇴행질환을 가진 노약자의 약물요법과 관련하여 노약자에게 isoquinoline 화합물을 포함한 dopamine 생합성 및 대사에 영향을 주는 물질, 산화 스트레스-유도 물질 등의 천연물을 장기간 투여하는 경우, 질환의 진행 및 약물상호작용의 면에서의 영향을 고찰하기 위한 것이다.
제안 방법
- )을 투여하여 회전운동을 평가하였다(300 회/시간 이상의 회전 운동). 6-OHDA 투여 동물에 대한 berberine(5 및 30 mg/ kg, i.p.)의 투여는 3 주간(1일 1회) 시행하였다.
- 파킨슨병은 흑질에서 dopamine 신경세포가 선택적으로 퇴행되어 나타나는 운동질환이다. 6-OHDA 투여 및 berberine 투여에 의한 흑질의 신경세포의 감소에 따른 뇌중의 dopamine 함량을 검토하였다. 뇌중의 dopamine 함량은 berberine(5 mg/kg) 투여군은 정상군에 비하여 변화가 없었으며, 6-OHDA 투여군은 처치부위(우측부위)에서 dopamine 함량이 감소하였다(대조군의 47% 감소)(Fig.
- 6-OHDA-유도 세포독성 측정 − 세포독성은 MTT 시약을 사용하여 세포생존율을 측정하여 계산하였다.
- 6-OHDA-유도 파킨슨병 동물 모델 − 파킨슨병 모델의 작성은 뇌부위에 6-OHDA를 투여하여 작성하였다.
- Dopamine 신경세포의 면역염색 − 6-OHDA 주입한 다음 4 주 후에 좌심실을 통한 관류고정(4% paraformaldehyde/50 mM phosphate 완충용액)을 시행한 다음 뇌를 적출하여 4% paraformaldehyde 용액에서 24 시간 고정 하였다.
- 고정된 뇌조직을 30% sucrose/PBS 용액/isobutane을 이용하여 동결박편을 제조하여 저온 보관하였다(두께 35 µm; Cryostat, Leica, Nuolch, Germany).
- PC12 세포(약 1×105 cells)를 96 well microplate에 분주하고 48 시간 배양한 다음, 이 세포에 berberine 또는 6-OHDA을 단독/병용 처치한 다음 24 시간 배양하였다. 세포 배양후 MTT 시약을 가한 후 용출된 formazan을 570 nm에서 측정하였다(Bauty Diagnostic Microplate Reader, Molecular Devices, CA, USA).
- 6 M KClacetonitrile(1:1, v/v) 혼합액 2 ml을 사용하여 용출시킨다. 용출액에 DPE 시약을 가하여 형광 유도체화한 다음 최종 반응액을 HPLC를 사용하여 dopamine 함량을 측정하였다. HPLC의 조건: column, TSK gel ODS 120T(5 µm, 0.
- 유세포분석(Flow cytometry analysis) − PC12 세포를 수집한 후 고정액[staining solution: 50 µg/ml propidium iodide, 0.05 mg/ml RNase A, 0.1 mM EDTA(pH 7.4) 용해 PBS]에서 실온, 30 분간 반응시킨 후 FACScan flow cytometer(Bekton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 측정하였다.
- 파킨슨병 모델은 6-OHDA(8 µg/2 µl, 2 주간)을 뇌실내 흑질부위 투여에 의하여 작성하였고, berberine(5 mg/kg 및 30 mg/kg, 3주간)은 파킨슨병 모델 동물(2 주간 6-OHDA 투여 동물)에 투여하였다.
- 5% cresyl violet 용액에 약 15-30 분간 반응시키고 3-5 분간 증류수에서 색분화(differentitation)를 시킨 다음 탈수시킨 후 (alcohol 사용) xylene으로 투명화하여 polymount에 봉입하였다. 흑질의 치밀부위의 염색성 측정은 광학현미경(x 100배, Zeiss Axiolab, Jena, Germany)을 사용하여 흑질에서 일정면적 내의 염색세포수를 계수하여 시행하였다.27)
대상 데이터
- PC12 세포 배양 − PC12 cells세포의 배양은 10% heatinactivated horse serum, 5% heat-inactivated fetal bovine serum이 포함된 RPMI medium 1640을 사용하였으며, CO2배양기(5%, 37℃)에서 배양하였다.
- 실험동물은 백서(Sprague-Dawley, male, 250-280 g)를 사용하였으며, 주야 주기 12 시간, 온도 23±2℃의 조건하에서 사육하였다.
- 실험재료 및 방법 실험재료 − L-DOPA, dopamine, berberine sulfate, 6- ODHA, apomorphine hydrochloride, bovine serum albumin, thiobarbituric acid, EDTA, ascorbic acid, 3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), 세포뱅양용 배지 및 serum 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 결과정리 − 단백질 함량은 소혈청 albumin을 사용하여 측정하였으며,29) 실험결과는 means±S.E.M.으로 표시하였으며 유의성 검정은 Tukey’s test에 의한 ANOVA 및 Student’s ttest에 의하여 계산하였다.
이론/모형
- Dopamine 함량 측정 - 뇌시료 중의 dopamine 함량은 Mitsui 등28) 및 Lee 등17)의 방법에 준하여 사용하였다. 시료에 trichloroacetic acid(3.
- PC12 cells were exposed to 6-OHDA (10, 20 and 50 µM) in the absence or presence of berberine (10 and 30 µM) for 24 h. The cell viability was assessed by the MTT method. Results represent means ± S.
- 파킨슨병 모델은 6-OHDA(8 µg/2 µl, 2 주간)을 뇌실내 흑질부위 투여에 의하여 작성하였고, berberine(5 mg/kg 및 30 mg/kg, 3주간)은 파킨슨병 모델 동물(2 주간 6-OHDA 투여 동물)에 투여하였다. 파킨슨병 발현은 6-OHDA 투여 2 주후에 apomorphine(0.5 mg/kg, s.c.) 투여에 의한 회전운동으로 확인하였으며, 조직내(흑색 치밀부위)의 신경세포사는 cresyl violet 염색법으로 검사하였다.
성능/효과
- Dopamine 신경세포의 퇴행의 주요 원인으로는 유전인자, 신경독성 물질 및 산화 스트레스(oxidative stress)에 의한 dopamine 신경세포사 등이 보고되고 있다.1) 파킨슨병의 증상완화/치료에는 L-3,4- dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) 요법이 가장 많이 선택되고 있으며, 투여된 L-DOPA는 뇌중으로 이행하여 방향족 L아미노산 탈탄산효소(aromatic L-amino acid decarboxylase, EC 4.1.1.28)에 의하여 dopamine으로 변환되어 약리작용을 나타내고 있다. 그러나 장기적인 L-DOPA 요법 파킨슨병 환자는 dopamine 함량이 증가하며, L-DOPA/dopamine 또는 대사체 상호간의 축합반응에 의한 tetrahydropapaveroline 및 salsolinol과 같은 isoquinoline 유도체가 생성되고 있음이 보고되고 있으며,2) L-DOPA/dopamine 및 그의 대사체는 산화 스트레스에 의한 신경독성을 나타낸다.
- 6-OHDA은 흑질에 투여되면 dopamine 흑질-선조체 경로만 선택적으로 파괴시키므로 dopamine 신경세포사(cell death)를 유도하고 이로 인하여 선조체 dopamine 함량이 감소된다.31,32)6-OHDA 투여한 다음 berberine을 병용 투여한 경우, dopamine 함량은 berberine 5 mg/kg 투여군에서는 미약한 감소를 나타내었으며, 30 mg/kg 투여군에서는 현저히 감소하였다(75.4% 감소)(Fig. 4). 이는 berberine의 투여농도의 증가에 따라 6-OHDA-유도 신경세포사의 유도가 증가함으로서 dopamine 신경세포에서의 dopamine 생합성이 감소되고 있음을 나타내고 있다.
- Cresyl violet 염색결과에 의하여 정상군은 흑질 치밀부위(sbustantia nigra compacta)과 흑질 외측부위(substantianigra reticulata)에서 염색된 신경섬유가 그물처럼 엉켜있었고, 세포체가 다각형 또는 난원형 모양이었다. 그러나 berberine(30 mg/kg) 투여군은 정상군에 비하여 신경세포의 염색성(신경세포체)이 감소하였으며, 6-OHDA와 berberine(5 및 30 mg/kg)을 병용 투여한 경우, 6-OHDA 단독 투여군과 비교하여 신경세포의 염색성이 현저히 감소하였다.
- Cresyl violet 염색결과에 의하여 정상군은 흑질 치밀부위(sbustantia nigra compacta)과 흑질 외측부위(substantianigra reticulata)에서 염색된 신경섬유가 그물처럼 엉켜있었고, 세포체가 다각형 또는 난원형 모양이었다. 그러나 berberine(30 mg/kg) 투여군은 정상군에 비하여 신경세포의 염색성(신경세포체)이 감소하였으며, 6-OHDA와 berberine(5 및 30 mg/kg)을 병용 투여한 경우, 6-OHDA 단독 투여군과 비교하여 신경세포의 염색성이 현저히 감소하였다. 이는 isoquinoline 화합물인 berberine은 6-OHDA 뇌실 투여에 의한 파킨슨병 유도 과정(발병 및 진행과정)에서 농도 의존적으로 흑질부위의 dopamine 신경세포 독성작용(신경세포사)에 대한 증가작용을 나타내고 있음을 제시하고 있다.
- 이상의 연구결과에 의하면 protoberberine 알카로이드인 berberine은 PC12 세포 및 파킨슨병 동물모델에서 6-OHDA유도 세포독성의 증가작용을 나타내고 있다. 그러므로 LDOPA 요법 중인 파킨슨병 환자 및 노약자는 berberine를 포함한 isoquinoline 화합물, dopamine 생합성 저해작용 및 산화 스트레스를 유도하는 물질(예 중금속) 등에 장기간 동안 투여/노출되는 경우 독성작용이 증가될 수 있음을 제시하였으며, 복용 용량과 기간에 따라 신경독성이 상승될 수 있다. 따라서 본 연구는 신경퇴행성 질환 환자 및 노약자에 대하여 천연물과의 약물상호작용, 품질관리 등에 대한 체계적인 연구가 진행되어야 할 것임을 제시하고 있다.
- 6-OHDA 투여 및 berberine 투여에 의한 흑질의 신경세포의 감소에 따른 뇌중의 dopamine 함량을 검토하였다. 뇌중의 dopamine 함량은 berberine(5 mg/kg) 투여군은 정상군에 비하여 변화가 없었으며, 6-OHDA 투여군은 처치부위(우측부위)에서 dopamine 함량이 감소하였다(대조군의 47% 감소)(Fig. 4). 6-OHDA은 흑질에 투여되면 dopamine 흑질-선조체 경로만 선택적으로 파괴시키므로 dopamine 신경세포사(cell death)를 유도하고 이로 인하여 선조체 dopamine 함량이 감소된다.
- 3B, C). 또한, 6-OHDA 투여군에서도 정상군에 비하여 현저히 신경세포군이 감소하였으며(Fig. 3D), 6-OHDA 투여군에 대하여 berberine을 병용 투여 하는 경우, berberine(5 mg/kg) 병용투여군은 6- OHDA 단독투여군에 비하여 신경세포군이 감소하는 경향을 나타내었으며(Fig. 3E), berberine(30 mg/kg) 병용투여는 6-OHDA 단독투여군 및 정상군과 비교하는 경우 신경세포군이 현저히 감소하였다(Fig. 3F). 이 결과로부터 berberine의 단독투여에 의하여 흑질부위의 신경세포는 감소되며, berberine의 신경세포 감소작용은 투여농도에 비례하여 발생하고 있음을 나타내고 있다.
- 또한, berberine(30 µM) 및 6-OHDA(20 µM)을 병용 처치하는 경우 세포사(apoptosis)는 23.4%을 나타내어 단독 처치군에 비하여 현저히 증가하였다(Fig. 2).
- 3F). 이 결과로부터 berberine의 단독투여에 의하여 흑질부위의 신경세포는 감소되며, berberine의 신경세포 감소작용은 투여농도에 비례하여 발생하고 있음을 나타내고 있다.
- 31) Isoquinoline 화합물은 MPTP와의 구조적 유사성으로 dopamine 생합성, 생합성 및 대사효소(TH 및 MAO) 저해작용, dopamine과 관련한 세포독성과 관련한 연구가 진행되어 왔다. 이 중에서 berberine을 포함한 protoberberine 알카로이드(palmatine, coptisine)는 dopamine 생합성 저해작용, TH 및 MAO 활성 저해작용을 나타내며,4,13,14) tetrahydopapaveroline은 dopamine 생합성 저해작용 이외에 L-DOPA-유도 세포독성 증가작용을 나타내며, 세포독성 작용은 산화 스트레스에 의한 것으로 밝혀졌다.9,17) 그러므로 berberine의 세포독성 작용은 tetrahydropapaveroline 등에서 나타난 것처럼 세포내 산화 스트레스와 관련한 세포사(apoptosis) 유도 작용에 의한 것이며, 이러한 세포독성 작용은 6-OHDA-유도 세포독성 작용에 대한 증가작용을 유도하고 있는 것으로 사료된다.
- 이상의 연구결과에 의하면 protoberberine 알카로이드인 berberine은 PC12 세포 및 파킨슨병 동물모델에서 6-OHDA유도 세포독성의 증가작용을 나타내고 있다. 그러므로 LDOPA 요법 중인 파킨슨병 환자 및 노약자는 berberine를 포함한 isoquinoline 화합물, dopamine 생합성 저해작용 및 산화 스트레스를 유도하는 물질(예 중금속) 등에 장기간 동안 투여/노출되는 경우 독성작용이 증가될 수 있음을 제시하였으며, 복용 용량과 기간에 따라 신경독성이 상승될 수 있다.
후속연구
- 그러므로 LDOPA 요법 중인 파킨슨병 환자 및 노약자는 berberine를 포함한 isoquinoline 화합물, dopamine 생합성 저해작용 및 산화 스트레스를 유도하는 물질(예 중금속) 등에 장기간 동안 투여/노출되는 경우 독성작용이 증가될 수 있음을 제시하였으며, 복용 용량과 기간에 따라 신경독성이 상승될 수 있다. 따라서 본 연구는 신경퇴행성 질환 환자 및 노약자에 대하여 천연물과의 약물상호작용, 품질관리 등에 대한 체계적인 연구가 진행되어야 할 것임을 제시하고 있다.
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