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문제 정의
- 본 연구는 약용식물 150점의 메탄올 추출물을 이용하여 in-vitro 에서 주로 문제시 되는 인삼병원균에 대한 항균활성을 조사하였고, 그 중 항균활성의 범위가 넓은 봉선화 (Impatiens balsamina) 추출물을 이용하여 인삼점무늬병 (Alternaria blight)에 대한 방제효과를 조사하고 봉선화 추출물중의 활성물질의 정제와 동정을 통해 생화학적 방제제로서의 이용 가능성을 평가하였다.
제안 방법
- In-vitro 검정을 통해 선발된 약용식물 추출물의 물리 화학적 안정성을 검토하고자 수행하였으며 열 및 pH에 관한 반응을 조사하였다. 열 안정성은 40, 60, 80, 100℃의 온도에서 1시간 동안 처리하였으며, pH 안정성은 DMSO에 용해시킨 추출물을 각각 pH가 4, 7, 10이 되게 조정하였다.
- 2 (Applied Biosystem, USA) 운용 소프트웨어를 통해 얻어졌다. Negative ion mode, Q1/Full Scan Mode를 사용하여 100-1300 m/z 이내의 모든 ion을 검출하였다. Curtain gas 20 psi, Heated gas 온도 700℃, Nebulizer gas 1, 2는 각각 60 psi, Ion Spray Voltage −4500 eV, Declustering Potential 값 −70 eV, Entrance Potential 값 −10 eV로 하였다.
- panax 균 분생포자의 대량 생산을 위해 배지와 광조건에 따른 포자생성량을 측정하였다. PDA (Potato Dextrose Agar), V8 Juice Agar 등 2종의 배지와 형광 및 NUV 두 가지 광조건 (12 hr Light, 12 hr Black)에서 수행하였으며 20℃의 배양기에서 5일간 배양하면서 Plate 당 포자생성량을 계수하여 접종원 배양을 위한 최적 조건을 조사하였다. 또한 포자접종 농도를 0~105/㎖로 달리하고 멸균수, V8 Juice 등 두 가지의 현탁액을 분무접종하고 25℃의 접종상 (상대습도 100%)에서 24시간 습실 처리한 후 25 ± 5℃의 온실에서 발병을 유도하였다.
- Silica gel column chromatography (CC, Wakogel C-200)를 이용하여 n-hexane, n-hexane (H): ethyl acetate(EtOAc) (HEA) 10 : 1, 4 : 1, EtOAc의 용매로 순차적으로 분획하고 TLC (Silica gel 60 F254, Merck)로 전개시켜 총 12개의 분획물을 얻었으며 이때 전개용매는 HEA, 4 : 1을 사용하였다. Paper disc법을 이용하여 항균활성 검정 후 활성보유 분획물을 silica gel column chromatography로 2차 분획하고 TLC (Silica gel 60 F254, Merck, HEA, 8 : 3)로 전개한 후 계속적으로 분획별 활성검정을 실시하여 최종적으로 화합물 I~V를 분리하였다 (Fig. 1).
- 선발 추출물 40 g으로부터 항균활성 물질의 분리를 시도하였다. Silica gel column chromatography (CC, Wakogel C-200)를 이용하여 n-hexane, n-hexane (H): ethyl acetate(EtOAc) (HEA) 10 : 1, 4 : 1, EtOAc의 용매로 순차적으로 분획하고 TLC (Silica gel 60 F254, Merck)로 전개시켜 총 12개의 분획물을 얻었으며 이때 전개용매는 HEA, 4 : 1을 사용하였다. Paper disc법을 이용하여 항균활성 검정 후 활성보유 분획물을 silica gel column chromatography로 2차 분획하고 TLC (Silica gel 60 F254, Merck, HEA, 8 : 3)로 전개한 후 계속적으로 분획별 활성검정을 실시하여 최종적으로 화합물 I~V를 분리하였다 (Fig.
- 본 시험에 사용된 150점의 약용식물 추출물은 시험포장 (수원)에서 2001~2002년 재배·수확한 약용식물과 중국에서 수집된 약용식물들을 사용하였다. 각각의 시료들을 물로 세척 후 65℃에서 1주일간 건조한 후, 밀링커터로 분말화하여 250 ㎛의 채로 친 후, 건조시료 중량 10배량의 메탄올 (100%, 70%)을 가해 환류냉각 추출법으로 74℃, 2시간, 2회 반복추출 하였으며, 여과지 (Advantec)로 여과하여 얻어진 액을 감압 농축하여 건조물을 조제하였다.
- 5%의 Tween 20 용액을 사용하였으며 대조약제로 디페노코나졸수화제를 사용하였다. 각각의 처리구 마다 A. panax 포자현탁액(V8 Juice 현탁)을 105/㎖의 농도로 분무접종 하였으며 2주후 각 처리구별로 이병엽율을 측정하였다.
- Alternaria panax, Botrytis cinerea, Fusarium sp.는 25℃에서 3일, Cylindrocarpon destructans 는 20℃에서 7일간 배양한 후 생장억제환 (inhibition zone)의 직경을 측정하여 항균활성 유무 및 정도를 검정하였다.
- 선발 추출물을 DMSO에 완전히 용해시킨 후 추출물의 농도가 0~1,000 ppm이 되도록 PDA 검정배지를 제작하였으며 배지상에 포함된 DMSO의 최종농도는 1% 이하가 되도록 하였다. 또한 0.5%의 Tween 20 용액속에 균일하게 현탁시킨 A. panax 분생포자를 103/plate 농도로 검정 배지에 도말하고 25℃ 배양기에서 24시간 경과 후 포자발아억제 최소농도(MIC)를 측정하였다.
- 또한 포자접종 농도를 0~105/㎖로 달리하고 멸균수, V8 Juice 등 두 가지의 현탁액을 분무접종하고 25℃의 접종상 (상대습도 100%)에서 24시간 습실 처리한 후 25 ± 5℃의 온실에서 발병을 유도하였다.
- 본 실험에서 접종원으로 이용할 A. panax 균 분생포자의 대량 생산을 위해 배지와 광조건에 따른 포자생성량을 측정하였다.
- 봉선화 메탄올 추출물을 Silica gel column chromatography 및 유기용매로 순차추출하고 얻어진 추출물들을 TLC (Silicagel 60 F254, Merck, HEA = 4 : 1, 47% H2SO4)로 12개의 분획물을 얻었다. 104/㎖로 분생포자를 PDA 배지상에 도말하고 Paper disc법을 이용하여 분획물 처리 후 25℃에서 배양하였을 경우 5번 분획물 만이 항균활성을 가지고 있음을 확인하였고 형성된 저지원의 크기가 30일 이상 변하지 않고 유지됨을 관찰하였다 (Fig.
- 봉선화 메탄올 추출물의 A. panax 균의 포자발아억제 최소 농도를 측정한 결과, 500 ppm 이상의 농도에서 포자의 발아가 완전히 억제되었으며 (Fig. 5) 이 농도를 온실에서의 In-vivo 활성검정 농도로 설정하였다.
- 선발 추출물 40 g으로부터 항균활성 물질의 분리를 시도하였다. Silica gel column chromatography (CC, Wakogel C-200)를 이용하여 n-hexane, n-hexane (H): ethyl acetate(EtOAc) (HEA) 10 : 1, 4 : 1, EtOAc의 용매로 순차적으로 분획하고 TLC (Silica gel 60 F254, Merck)로 전개시켜 총 12개의 분획물을 얻었으며 이때 전개용매는 HEA, 4 : 1을 사용하였다.
- 선발 추출물을 DMSO에 완전히 용해시킨 후 추출물의 농도가 0~1,000 ppm이 되도록 PDA 검정배지를 제작하였으며 배지상에 포함된 DMSO의 최종농도는 1% 이하가 되도록 하였다. 또한 0.
- In-vitro 검정을 통해 선발된 약용식물 추출물의 물리 화학적 안정성을 검토하고자 수행하였으며 열 및 pH에 관한 반응을 조사하였다. 열 안정성은 40, 60, 80, 100℃의 온도에서 1시간 동안 처리하였으며, pH 안정성은 DMSO에 용해시킨 추출물을 각각 pH가 4, 7, 10이 되게 조정하였다. 활성검정방법은 in-vitro 검정방법과 동일하게 수행하였다.
- 온실에서의 인삼점무늬병 방제효과를 조사하였다. 수원 작물과학원 인삼 재배포장에서 생육 중에 있는 무병의 2년근 재래종 인삼을 포트에 이식 후 1주일이 경과한 시점에서 지상부가 정상적으로 생육하고 있는 시료를 골라 실험에 사용하였다.
- 인삼병원균에 강한 항균활성을 보인 봉선화 (I. balsamina) 메탄올 추출물을 선발하여 물리·화학적 안정성을 평가하였는데 그 실험 결과는 Fig. 3과 같다.
- 인위적으로 A. panax의 분생포자를 형성시키기 위한 최적 조건을 조사하였다. Fig.
대상 데이터
- Fig. 4의 결과와 같이 V8 Juice Agar 배지에서 형광조건으로 Plate를 밀폐하지 않고 3일간 배양 했을 때 5 × 105 spores/Plate 이상의 포자를 대량으로 획득하였다.
- 수원 작물과학원 인삼 재배포장에서 생육 중에 있는 무병의 2년근 재래종 인삼을 포트에 이식 후 1주일이 경과한 시점에서 지상부가 정상적으로 생육하고 있는 시료를 골라 실험에 사용하였다. 대조구로는 1%의 DMSO를 혼합하고 있는 0.5%의 Tween 20 용액을 사용하였으며 대조약제로 디페노코나졸수화제를 사용하였다. 각각의 처리구 마다 A.
- 본 시험에 사용된 150점의 약용식물 추출물은 시험포장 (수원)에서 2001~2002년 재배·수확한 약용식물과 중국에서 수집된 약용식물들을 사용하였다.
- 온실에서의 인삼점무늬병 방제효과를 조사하였다. 수원 작물과학원 인삼 재배포장에서 생육 중에 있는 무병의 2년근 재래종 인삼을 포트에 이식 후 1주일이 경과한 시점에서 지상부가 정상적으로 생육하고 있는 시료를 골라 실험에 사용하였다. 대조구로는 1%의 DMSO를 혼합하고 있는 0.
- Curtain gas 20 psi, Heated gas 온도 700℃, Nebulizer gas 1, 2는 각각 60 psi, Ion Spray Voltage −4500 eV, Declustering Potential 값 −70 eV, Entrance Potential 값 −10 eV로 하였다. 이동상은 이온화를 돕기 위해 각각 1 mM ammonium acetate를 첨가한 acetonitrile (ACN)과 3차 증류수를 사용하였다. Column은 Waters Acquity C18 (1.
데이터처리
- 분리한 화합물은 3200 QTrap ESI-LC/MSMS (Applied Biosystems, USA)을 사용하여 분자량을 측정하였고, MS 데이터는 Analyst 1.4.2 (Applied Biosystem, USA) 운용 소프트웨어를 통해 얻어졌다.
이론/모형
- 약용식물 추출물의 항균활성은 paper disc (Advantec, 8 ㎜ in diameter) 법을 이용하여 검정하였다. 각각의 메탄올 추출물을 10 ㎎/㎖ 농도로 DMSO 에 녹인 후 Paper disc에 50 ㎕씩 처리하여 용매를 완전히 제거한 후 균이 접종된 중층배지에 치상하였다.
- 열 안정성은 40, 60, 80, 100℃의 온도에서 1시간 동안 처리하였으며, pH 안정성은 DMSO에 용해시킨 추출물을 각각 pH가 4, 7, 10이 되게 조정하였다. 활성검정방법은 in-vitro 검정방법과 동일하게 수행하였다.
성능/효과
- 봉선화 메탄올 추출물을 Silica gel column chromatography 및 유기용매로 순차추출하고 얻어진 추출물들을 TLC (Silicagel 60 F254, Merck, HEA = 4 : 1, 47% H2SO4)로 12개의 분획물을 얻었다. 104/㎖로 분생포자를 PDA 배지상에 도말하고 Paper disc법을 이용하여 분획물 처리 후 25℃에서 배양하였을 경우 5번 분획물 만이 항균활성을 가지고 있음을 확인하였고 형성된 저지원의 크기가 30일 이상 변하지 않고 유지됨을 관찰하였다 (Fig. 7). 활성 분획물을 Silica gel column chromatography로 2차 분획하고 TLC (Silica gel 60 F254, Merck, HEA, 8 : 3)로 전개한 후 계속적으로 분획별 활성검정을 실시하고 활성분획을 분리 정제하여 최종적으로 화합물 I~V를 분리하였고 이들 화합물의 분자량을 3200 QTrap ESILC/MSMS (Applied Biosystems, USA)로 측정한 결과 화합물 I~V의 분자량은 각각 m/z 562, 188, 340, 370, 176이었으며 이중 분자량 188의 화합물 II를 High resolution-LC/MS/MS로 분석하여 C11H8O3의 분자식을 가진 화합물로 Kang et al.
- 3과 같다. 40, 60, 80, 100℃의 온도에서 열처리 후 Paper disc법으로 항균활성을 검정해본 결과, 대조구와 비교하여 활성의 정도가 변하지 않았음을 확인하였고 강산, 강염기의 조건에서도 그 활성의 정도가 변하지 않음을 확인하였다.
- A. panax의 분생포자는 몸체의 크기가 24~92 × 16~21 ㎛이며, 부리부분은 12~28 × 4~8 ㎛이고 분생자경의 크기는 35~48 × 4~5 ㎛이다.
- 4의 결과와 같이 V8 Juice Agar 배지에서 형광조건으로 Plate를 밀폐하지 않고 3일간 배양 했을 때 5 × 105 spores/Plate 이상의 포자를 대량으로 획득하였다. PDA배지보다는 V8 Juice Agar 배지에서 월등히 많은 양의 분생포자가 형성되었는데 PDA배지에서 sealing후 배양 했을 경우 전혀 포자가 형성되지 않았으며 NUV 보다는 형광조건에서 분생포자의 형성이 많았다. 따라서 특히 plate의 밀폐 여부 즉 통기 유무가 분생포자 형성에 중요한 요인으로 작용한다고 사료된다.
- cinerea, Fusarium sp. 균에 대해 각각 32 ㎜, 30 ㎜, 18.5 ㎜의 생육저지환을 형성하였으며 (Table 1), 광학현미경으로 검정배지상의 저지원이 형성된 부위의 Alternaria 균사말단에서 생육저해가 관찰되었다 (Fig. 2).
- destructans, Fusarium sp. 등 4종의 주요 인삼병원균에 대해 약용식물 추출물 150점의 항균 활성을 조사한 결과, 황련 (Coptis chinensis)과 봉선화(Impatiens balsamina) 추출물이 2종류 이상의 균주에 대해 강한 항균활성을 보였다. 황련 추출물의 경우, A.
- 따라서 이번 연구에서 150점의 약용작물 메탄올 추출물을 이용해 인삼점무늬병균(A. panax)에 대한 항균활성을 검정하고 선발된 봉선화 메탄올 추출물을 silica gel column chromatography, 유기용매 및 TLC를 이용하여 분리 정제하여 ESI-LC/MS/MS 기기 분석을 통해 활성물질을 동정하고 기존 문헌상의 결과를 종합적으로 고찰하여 볼 때 봉선화 메탄올 추출물로부터 분리한 화합물 2-methoxy-1,4-naphthoquinone이 인삼점무늬병균 (A. panax)에 항균활성을 나타내는 유효성분일 것으로 판단된다.
- 시간의 경과에 따른 포자생성 정도를 보면 Plate를 sealing하지 않은 조건에서 배양 후 1일이 경과한 후에 현미경상으로 많은 포자가 관찰되었으나 5일이 경과한 후에는 모든 처리구에서 포자생성이 증가하지 않음이 관찰되었다.
- 그러나, 포자를 V8 Juice 에 현탁하여 분무접종을 하였을 경우 102/㎖, 103/㎖, 104/㎖, 105/㎖의 농도에서 각각 20, 60, 80, 100%의 이병엽율을 보였다. 위의 결과로부터 인위적으로 A. panax 균을 접종하고 병을 일으키기 위해서는, 접종시 발아관의 생성 및 침입하기까지 균의 생육에 필요한 영양분이 필요함이 유추되었다.
후속연구
- 6에서 보는바와 같다. 봉선화 메탄올 추출물을 처리했을 때의 이병엽율은 13%로 등록약제 처리시 이병엽율 9%에 비해 다소 높았으나 무처리 대조구 35% 등 타처리구 보다 낮은 이병엽율을 보여 방제재로서의 가능성을 보였으며 선발 추출물의 제형화 등 추후 포장에서의 방제효과 검증 시험이 필요하다.
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