선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 Aβ의 분비를 감소시키는 약물을 선발하기 위해 국내 자생식물의 추출물을 스크리닝한 결과, 봉선화 전초의 MeOH 추출물이 APP의 변이 유전자인 APPswe를 발현하는 신경세포주에서 α-secretase의 활성을 증가시킴과 동시에 BACE의 활성을 감소시킴으로써 APP의 대사를 조절하고 Aβ의 분비를 감소시켰기에 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- − β-secretase에 대한 저해활성은 BACE-1 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 분석 키트(PanVera Co, Madison, WI)를 사용하여 측정하였다.
- − APPswe 세포주로부터 분비되는 Aβ의 양을 측정하기 위해 sandwich ELISA17) 를 실시하였다.
- 단백질 50 μg을 7%, 14% Trisglycine SDS-PAGE로 분리한 후, immunoblotting에 의해 APP, sAPPα, PS1 등의 단백질 양상을 분석하였다. 3회 반복 실험에 의해 얻어진 단백질 밴드를 Image J 1.37 software(NIH 제공)에 의해 정량하였으며 actin 밴드를 기준으로 보정하였다.
- 5×103 세포를 96 well plate에서 배양하여 DMSO에 용해시킨 IBM을 1, 10, 50, 100 μg/ml 농도로 24시간 처리하였다.
- APP 를 기질로 하여 Aβ의 생성에 관여하는 β-secretase의 효소활성을 농도 의존적으로 저해하는 것도 확인하였다.
- CCK-8 용액(Water-soluble tetrazolium salt) 10 μl를 첨가하여 2시간 배양한 후, 450 nm에서 Model 680 Microplate Reader(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 흡광도를 측정 하였다.
- APPswe cells were treated with DMSO (control), 1, or 10 μg/ml of IBM for 24 h, then collected conditioned media and lysed with cell lysis buffer. Medium or detergent lysates were loaded on the 7%, 14% Tris-glycine SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting with rabbit anti-APP polyclonal antibody, rabbit anti-PS1 polyclonal antibody, rabbit anti-actin polyclonal antibody, or anti-APP monoclonal antibody. Note that sAPPα was increased.
- sAPPα의 증가는 α-secretase의 활성증가를 시사하는 것이며 이 결과를 통해 β-secretase의 활성감소를 예상할 수 있기 때문에 β-secretase 의 활성을 측정하기 위해 BACE FRET 분석을 실시하였다.
- 단백질 50 μg을 7%, 14% Trisglycine SDS-PAGE로 분리한 후, immunoblotting에 의해 APP, sAPPα, PS1 등의 단백질 양상을 분석하였다.
- 즉, 음성 대조 군(CON)인 DMSO를 처리한 시료의 Aβ의 분비량을 100%로 하여 IBM을 처리한 경우의 분비량을 백분율로 표시하였다.
대상 데이터
- − APP swedish 유전자가 과잉 발현되는 생쥐유래 신경세포주인 Neuro2a(APPswe)를 동경대학의 Iwatsubo 교수로부터 제공받아 5% FBS(Gibco, Grand Island, NY), Lglutamic acid, penicillin/streptomycin, hygromycin이 함유된 Dulbecco's Modified Eagel's Medium(Gibco, Grand Island, NY)과 OPTI MEM(Gibco, Grand Island, NY)의 혼합 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
- −봉선화(Impatiens balsamina L.) 전초의 MeOH 추출물(이하 IBM으로 略함)은 한국 추출물은행으로부터 구입 하여 DMSO에 100 mg/ml 농도로 용해한 후, 희석하여 사용하였다.
데이터처리
- − APPswe 세포주에 IBM 을 처리한 후 배양액으로 분비된 Aβ의 양을 sandwich ELISA 방법으로 측정하여 비교 정량하였다.
- −각 실험군(n=3) 간의 유의성 검정은 Student's t-test로 하였으며, P값이 0.05 및 0.01 이하를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
이론/모형
- − IBM의 APPswe 세포주에 대한 독성을 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 assay를 실시하였다.
- 단백질 분석 −단백질 분석은 Western blotting 방법에 의해 수행하였다.
성능/효과
- 노인인구의 증가와 더불어 치매환자 수도 급속히 증가하고 있어 개인의 삶의 질을 저하시킬 뿐만 아니라 과다한 의료비 지출로 인한 커다란 사회·국가적 문제로까지 대두되고 있다.1) 알츠하이머 질환은 치매의 가장 주요한 발병요인으로서 familial type과 sporadic type으로 분류되며, 전체 질환의 90% 이상이 주로 65세 이상의 노인에게 나타나는 sporadic type이다.2) Familial type은 amyloid precursor protein(APP), presenilin 1(PS1), presenilin 2(PS2) 유전자의 돌연변이가 병인으로 알려져 있으며,3) sporadic type의 경우는 그 원인이 노화 및 ApoE4 대립형질의 다양성이 병인으로 보고되었다.
- 30) 본 실험에 사용한 APPswe 세포주는 치매환자의 병리와 유사하게 Aβ42의 분비량이 정상세포에 비해 2배 이상 증가 되어 있어 분비저해 활성을 검색하기에 용이하다.
- 7) 알츠하이머 질환 치료제 개발을 위한 표적 중 하나인 γ-secretase는 presenilin (PS), nicastrin(NCT)과 anteria pharynx defective gene의 단백질 산물인 APH-1, presenilin enhancer gene의 단백질 산물인 PEN-2 등으로 이루어진 complex로서 활성을 나타낸다.
- IBM은 APP의 단백질 양상에는 큰 영향이 없었으나, 배양세포주의 배양액으로부터 sAPPα 단백질 양상을 분석한 결과, IBM 1, 10 μg/ ml로 처리한 경우 DMSO 처리군(CON)에 비해 각각 2.33, 2.95배로 현저히 증가시켰다(Fig. 4A).
- 그 결과, IBM 1, 10 μg/ml 처리는 BACE 활성을 저해하여 DMSO 처리군(CON)에 비해 각각 79.07±3.5%, 55.23±1.8%의 효소활성을 나타냈다.
- 본 실험에 사용한 농도인 1, 10 μg/ ml을 처리한 세포의 생존력은 각각 103.13±3.3, 110.35±3.6%를 나타내었다(Fig. 2).
- 이 결과를 통하여 APP의 최종 대사과정에 관여하는 효소 γ- secretase 복합체의 중요한 구성분자인 PS-NTF의 안정성에는 영향이 없으며, 다른 구성분자인 NCT, PS1-CTF, PEN2, APH-1 등의 안정성에도 변화가 없음을 추정할 수 있다.
후속연구
- γ-secretase의 구성분자인 PS1의 단백질 양상에는 영향이 없었으며 활성을 나타내는 농도의 10배 농도에서도 세포독성은 관찰 되지 않았다. 이러한 결과를 종합해보면 IBM은 β-secretase를 표적으로 하는 치매 치료제 개발을 위한 후보자원으로서 개발가치가 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 종합해보면, IBM을 치매 치료제 개발을 위한 β-secretase 저해 후보약물로 응용할 수 있다고 사료된다.
- 향후 봉선화에 의한 Aβ 분비저해활성의 기전을 명확히 규명하기 위해서는 면역형광염색법에 의해 APP 및 관련 분자의 세포내 분포를 확인하고, BACE 및 γ-secretase의 in vitro 효소활성도 측정해야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.