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문제 정의
- 본 연구는 조간대에 서식하여 시험생물로 취급이 용이한 말똥성게(Henicentrotus pulcherrimus)를 이용하여, 수정 및 배 발생을 위한 적정 염분농도 범위를 조사하고자 하였다. 또한, 표준 독성물질인 Cu(Aldrich, USA)와 Cd (Aldrich, USA)에 의한 H. pulcherrimus의 수정 및 배 발생 변화를 살펴서 생태독성 평가를 위한 타당성을 파악하고자 하였다.
- 본 연구는 말똥성게, Hemicentrotus pulcherrimus 의 수정 및 배 발생률을 이용해 해양에 유입되는 유해물질의 생태독성을 타당하게 평가할 수 있는 가를 살펴보고자 하였다. 실험조건상 해양생물이라는 특수성을 고려하여 적정 염분농도와 표준 독성물질인 Cu와 Cd 농도 변화에 따른 수정 및 배 발생률이 조사되었다.
- 본 연구는 조간대에 서식하여 시험생물로 취급이 용이한 말똥성게(Henicentrotus pulcherrimus)를 이용하여, 수정 및 배 발생을 위한 적정 염분농도 범위를 조사하고자 하였다. 또한, 표준 독성물질인 Cu(Aldrich, USA)와 Cd (Aldrich, USA)에 의한 H.
제안 방법
- 6개의 Cu와 Cd 농도 용액으로 조성된 실험구에 30분간 노출된 정자를 난자에 첨가하여 10분 후에 수정률과 64h 후에 배 발생률을 관찰하였다.
- 각기 다른 농도의 염분에 30분간 노출시킨 정자를 난자에 첨가하여 10분경과 후에 수정막의 유∙무로 수정의 유무를 판단하였다. 배 발생률은 수정 시킨 후, 64 h 경과했을 때의 정상 pluteus 유생 수를 계수하였다.
- 방정을 통해서 얻은 정자를 각각 다른 농도로 조성한 염분 및 표준 독성물질에 30분간 노출시킨 후에 방란을 통해 얻은 난자를 첨가해 10분간 경과한 후에 수정막의 형성 유∙무로 수정률을 파악하였다. 수정막의 유∙무는 cap tube에 분주하여 formalin 용액(3%)으로 고정해 광학현미경으로 관찰 하였다(Fig.
- 각기 다른 농도의 염분에 30분간 노출시킨 정자를 난자에 첨가하여 10분경과 후에 수정막의 유∙무로 수정의 유무를 판단하였다. 배 발생률은 수정 시킨 후, 64 h 경과했을 때의 정상 pluteus 유생 수를 계수하였다.
- 방정을 통해서 얻은 정자를 각각 다른 농도로 조성한 염분 및 표준 독성물질에 30분간 노출시킨 후에 방란을 통해 얻은 난자를 첨가해 10분간 경과한 후에 수정막의 형성 유∙무로 수정률을 파악하였다. 수정막의 유∙무는 cap tube에 분주하여 formalin 용액(3%)으로 고정해 광학현미경으로 관찰 하였다(Fig. 1).
- 해양생태 독성평가를 실시함에 있어, 대상 실험 생물이 광염성 인지를 판단하는 것은 중요한 의미를 지니고 있다. 실험생물이 광염성이라면 해수에서 뿐만 아니라 기수지역에서 발생되는 유해물질에 대한 생물 영향 또는 방조제 건설 등으로 인해 염분 농도가 낮은 지역의 해수 혹은 퇴적물에 대한 평가를 실시할 수 있다. 물론 인위적으로 조사하고자 하는 유해물질에 대한 염분 농도를 조절하여 생물의 영향을 파악할 수 있지만, 대상물질이 가지고 있는 고유독성에 변화를 줄 수 있어(Hall et al.
- 실험에 사용된 염분 및 표준 독성물질인 중금속 농도를 조성한 배양액의 pH는 7.8~8.2로 Kobayasi(1973)가 제시한 성게의 수정막형성에 가장 적합한 pH의 범위와 동일하게 유지하였으며, 배양온도는 16±0.5oC로 조성하였다.
- 실험은 각 실험농도별로 3회를 실시한 후, 실험 액에 노출된 100개 이상의 배아를 3회 반복 계수 하여 고정된 배아 수에 대한 정상적인 배아 수의 백분율을 산출하였다. 이들 결과를 이용하여 표준 독성물질이 수정 및 배 발생률에 대한 반수영향농도(50% Effective Concentration, EC50)를 probit 통계법을 이용하여 분석하였다.
- 본 연구는 말똥성게, Hemicentrotus pulcherrimus 의 수정 및 배 발생률을 이용해 해양에 유입되는 유해물질의 생태독성을 타당하게 평가할 수 있는 가를 살펴보고자 하였다. 실험조건상 해양생물이라는 특수성을 고려하여 적정 염분농도와 표준 독성물질인 Cu와 Cd 농도 변화에 따른 수정 및 배 발생률이 조사되었다.
- 염분농도는 자연해수에 인공염(Tropic Marine CO.)과 증류수를 사용하여 10, 15, 20, 25, 30 및 35 psu가 되도록 6개의 시험액을 조성하여 각각의 시험액에서 배양을 실시하였다.
- 45 μm)로 여과하여 사용되었다. 이 여과된 자연 해수를 80 mL의 비이커에 가득 채운 후 성게의 생식공이 충분히 잠기게 한 다음 0.5 M KCl 용액 1~2 mL를 체강내로 주입해, 30분 동안 방정∙방란시켜 얻은 배우자를 정자용액은 1회, 난자용액은 3회 세정하여 실험에 사용하였다(Fujisawa, 1989).
- 정상적인 배 발생률은 난자를 첨가한지 64 h 후에 formalin 용액(3%)으로 고정해 광학현미경으로 관찰하여, 정상과 비정상(작은 크기 혹은 기형) pluteus으로 나누어 관찰하였다(Pagono et al., 1995a, b) (Fig. 2).
대상 데이터
-
2. 방정 및 방란
방정과 방란을 위해 사용된 실험생물 수는 20개체로 각경이 3.5 cm 이상 되는 개체를 선별하였으며, 오염을 방지하기위해 여과해수로 3회 이상 세척하였다. 실험시 사용된 해수는 자연해수를 UV carbonfilter로 처리한 후 membrane filter (pore size 0.
- 본 연구에 사용된 실험생물은 분류학적으로 극피동물문(Echinodermata)의 일종인 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus)로 2008년 주 산란시기인 3~4월에 전라북도 부안군 변산면 격포리 수산종묘배양장 인근해역, 수심 0~4 m의 암반지대인 조간대에서 채취하여 서식처와 유사한 환경조건을 조성하여 운반 및 실험에 사용하였다.
- 실험시 사용된 해수는 자연해수를 UV carbonfilter로 처리한 후 membrane filter (pore size 0.45 μm)로 여과하여 사용되었다.
- 표준 독성물질은 Cu (Aldrich, USA)와 Cd (Aldrich, USA)을 이용하였으며, 실험생물의 배우자와 배아에 노출시킬 표준 독성물질 시료는 여과된 자연해수와 1,000 μg/mL 표준용액을 이용한 사전실험에 의해 농도를 설정하였다.
데이터처리
- Cu와 Cd이 성게의 수정 및 배아 형성에 미치는 영향에 대한 실험 결과를 바탕으로, probit 통계법을 이용하여 EC50을 산출하였고, Dunnett’s test을 이용하여 NOEC와 LOEC를 산출하였다(Table 2).
- 또한, 무영향관찰농도(No Observed Effective Concentration, NOEC), 최소 영향관찰농도(Lowest Observed Effective Concentration, LOEC)는 Dunnett’s test를 이용하여 분석하였다.
- 실험은 각 실험농도별로 3회를 실시한 후, 실험 액에 노출된 100개 이상의 배아를 3회 반복 계수 하여 고정된 배아 수에 대한 정상적인 배아 수의 백분율을 산출하였다. 이들 결과를 이용하여 표준 독성물질이 수정 및 배 발생률에 대한 반수영향농도(50% Effective Concentration, EC50)를 probit 통계법을 이용하여 분석하였다. 또한, 무영향관찰농도(No Observed Effective Concentration, NOEC), 최소 영향관찰농도(Lowest Observed Effective Concentration, LOEC)는 Dunnett’s test를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- Cu를 첨가하지 않은 대조구에서는 98%로 높은 수정률을 나타내었으나, Cu 농도가 증가할수록 수정률은 급격히 감소해(r=-0.80), 12.5 ppb에서는 85%를 나타냈으며, 25 ppb 이상에서는 10% 미만의 수정률을 나타내었다(Fig. 4). 배 발생률은 수정률과 유사하게 Cu의 농도가 증가할수록 급격히 감소하는 경향을 나타냈으며(r=-0.
- NOEC는 수정률에서 125 ppb와 배 발생률에서 ⁄125 ppb를 나타냈으며, LOEC는 수정률의 경우 250 ppb, 배 발생률의 경우 125 ppb를 나타났다(Table 2). H. pulcherrimus의 수정률과 배 발생률을 이용한 독성평가에서 Cu가 Cd에 비해 독성영향이 강한 것으로 나타났다.
- NOEC는 수정률에서 125 ppb와 배 발생률에서 ⁄125 ppb를 나타냈으며, LOEC는 수정률의 경우 250 ppb, 배 발생률의 경우 125 ppb를 나타났다(Table 2).
- 표준 독성물질인 Cu와 Cd에 노출된 성게의 수정 및 배 발생률이 독성물질의 농도가 증가할수록 급격히 감소하는 경향을 나타내 성게의 수정 및 배 발생률은 독성물질의 노출에 따른 생물 영향의 정도를 파악하기에 적절한 것으로 판단된다. 동일 독성물질 농도에 대한 영향은 수정률보다 배 발생률의 저해현상이 크게 나타나는 것으로 보아, pluteus 유생시기의 배아가 표준 독성물질에 더 오랫동안 노출되어 있어 배 발달 과정 중 저해정도가 증가되었을 것으로 생각된다. 또한, 독성물질에 대한 노출은 pluteus 이전에 저해를 받았다 할지라도 형태적으로 빈약한 시기보다는 분화 정도가 진전된 pluteus 유생시기의 배아가 독성에 대해 더욱 증폭되어 표현되기 때문에, 환경에 대한 배아의 저해현상이 pluteus 형성시기에 더욱 뚜렷하게 관찰되는 것으로 판단된다(Pagono et al.
- 염분 농도 20 psu 이하에 노출된 정자의 수정률은 30% 미만으로 낮았으나, 25 psu 이상의 염분 농도에서는 거의 90%의 높은 수정률을 나타냈다. 배 발생률은 25 psu 이하의 농도에서 60% 미만을 나타냈고, 30~35 psu에서는 80% 이상을 나타내, 정상적인 수정을 위한 염분농도는 25~35 psu이고 정상적인 배발생을 위한 염분농도는 30~35 psu였다. 표준 독성물질인 Cu와 Cd의 농도가 증가할수록 수정률(r=-0.
- 6). 배 발생률은 수정률과 유사하게 Cd의 농도가 증가할수록 배 발생률은 급격히 감소하는 경향을 나타냈으며(r=-0.82), 500 ppb에서는 23%, 1,000 ppb 이상에서는 10% 미만을 나타내었다(Fig. 7).
- 3). 배 발생률의 경우는 20 psu 이하의 염분 농도에서는 정상적인 pluteus 유생을 거의 찾아 볼 수가 없었으나, 25 psu에서는 62%를 나타냈으며 30 psu와 35 psu에서는 83%와 91%로 높게 나타났다(Fig. 3).
- 본 연구결과에서 말똥성게(Henicentrotus pulcherrimus)의 정상적인 수정을 위한 염분농도는 25~35 psu의 범위로 나타났고, 정상적인 배 발생률을 위한 염분농도는 30~35 psu의 범위인 것으로 판단되었다. 또한, 수정난 검경시에 15 psu 이하의 농도에서는 난이 수정이 되지 않거나, 기존의 난보다 커져있거나 터져있는 경우가 많았으며, 20 psu에서는 수정은 되었으나 정상적인 pluteus를 발견하기 어려웠다.
- Kobayashi (1995)는 본 연구 결과와 유사하게 중금속이 성게의 초기 배 발생에 미치는 영향에서 중금속 중 Hg가 가장 큰 저해를 보였으며, Cu¤Zn¤Ni¤Cd의 순으로 영향을 미치는 것으로 보고하고 있다. 본 연구결과에서도 수정률의 경우 Cu에 대한 EC50은 17.30 ppb였으며, Cd의 경우는 364.57 ppb로 Cu가 Cd에 독성이 큰 것으로 나타났다. 배 발생률의 경우도 Cu에 대한 EC50은 10.
- 아므르 불가사리(Asterias amurensis)의 경우는 Hg¤Cu¤Zn¤Cd¤Ni의 순서로 독성이 크며, 별 불가사리(Asterina pectinifera)의 경우에는 Cu¤Hg¤Zn¤Cd¤Ni 순서로 독성이 큰 것으로 나타났다.
- 염분 농도 20 psu 이하에 노출된 정자의 수정률은 30% 미만으로 낮았으나, 25 psu 이상의 염분 농도에서는 거의 90%의 높은 수정률을 나타냈다. 배 발생률은 25 psu 이하의 농도에서 60% 미만을 나타냈고, 30~35 psu에서는 80% 이상을 나타내, 정상적인 수정을 위한 염분농도는 25~35 psu이고 정상적인 배발생을 위한 염분농도는 30~35 psu였다.
- 염분 농도 20 psu 이하에 노출된 정자의 수정률은 30% 미만으로 낮았으나, 25 psu에서는 87%로높아졌고 30 psu와 35 psu에서는 99%와 98%로 높은 수정률을 나타내었다(Fig. 3). 배 발생률의 경우는 20 psu 이하의 염분 농도에서는 정상적인 pluteus 유생을 거의 찾아 볼 수가 없었으나, 25 psu에서는 62%를 나타냈으며 30 psu와 35 psu에서는 83%와 91%로 높게 나타났다(Fig.
- 우리나라에서 산업적 혹은 생물검정 시험으로 이용되는 성게는 조간대에 서식하는 H. pulcherrimus와 수심 2~10 m의 조하대에 서식하는 둥근 성게(Strongylocentrotus nudus)와 북쪽말똥성게(Strognylocentrotus intermedius) 등이 있으나, 같은 성게라 할지라도 다양한 환경변화에 노출되는 H. pulcherrimus보다 조하대에 서식하는 S. nudus와 S. intermedia가 더 민감할 것으로 생각된다. 실제로 Hwang et al.
- 표준 독성물질인 Cu와 Cd에 노출된 성게의 수정 및 배 발생률이 독성물질의 농도가 증가할수록 급격히 감소하는 경향을 나타내 성게의 수정 및 배 발생률은 독성물질의 노출에 따른 생물 영향의 정도를 파악하기에 적절한 것으로 판단된다. 동일 독성물질 농도에 대한 영향은 수정률보다 배 발생률의 저해현상이 크게 나타나는 것으로 보아, pluteus 유생시기의 배아가 표준 독성물질에 더 오랫동안 노출되어 있어 배 발달 과정 중 저해정도가 증가되었을 것으로 생각된다.
- 배 발생률은 25 psu 이하의 농도에서 60% 미만을 나타냈고, 30~35 psu에서는 80% 이상을 나타내, 정상적인 수정을 위한 염분농도는 25~35 psu이고 정상적인 배발생을 위한 염분농도는 30~35 psu였다. 표준 독성물질인 Cu와 Cd의 농도가 증가할수록 수정률(r=-0.80, r=-0.78)과 배 발생률(r=-0.90, r=-0.82)이 급격히 낮아져 독성물질에 민감하게 반응하는 것으로 나타났다. 또한, Cu와 Cd의 EC50은 수정률의 경우 17.
후속연구
- 산업폐수, 기름 및 유화제 등과 같은 유해물질의 평가는 실험해수의 염분과 수소이온농도 같은 실험조건을 급격히 변화시켜서, 인위적으로 조절할 경우 유해물질이 가지고 있는 고유독성에 변화를 줄 수 있다(Kobayasi, 1980; Greenwood, 1983; Dinnel and Stober, 1987). 따라서, 각 종에 대한 적정한 염분 내성 범위와 같은 실험조건을 설정하고 유해물질의 독성에 대한 민감도를 좀 더 체계화시켜 관찰한다면, 성게의 수정 및 배 발생단계를 이용한 시험을 해양 생태독성 평가를 위해 널리 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
- pulcherrimus보다 염분변화에 더욱 민감한 결과를 나타내었다. 따라서, 같은 성게 종이라 할지라도 서식환경과 같은 염분변화에 의해서 수정 및 배 발생률에 차이가 나타날 수 있음으로, 성게를 실험생물로 이용한 해양생태독성평가 공정시험법을 만들기 위해서는 종에 따른 실험조건 혹은 유해물질에 대한 민감성이 사전에 연구되어야 할 것으로 판단된다.
- 이들 결과를 바탕으로, H. pulcherrimus의 수정 및 배 발생률은 해양 유해물질의 생태독성평가를 위한 유용한 생물학적 시험법으로 판단된다.
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