말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus)의 초기배아 발생과 glutathione S-transferase (GST)의 발현에 대한 bisphenol A의 영향 Effect of Bisphenol A on Early Embryonic Development and the Expression of Glutathione S-transferase (GST) in the Sea Urchin (Hemicentrotus pulcherrimus)원문보기
본 연구는 시험생물로서 말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus)를 이용하여 내분비계장애물질인 bisphenol A(BPA)의 독성 및 시험생물로서의 적합성 등을 조사하였다. 말똥성게(H. pulcherrimus)의 수정 및 정상 배아발생에 미치는 BPA의 독성을 보기 위하여 농도(0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb)에서 조사하였다. BPA 노출 시 수정률은 시험구간 내의 BPA 처리농도와 관계없이 유의적인 변화가 없었다. 정상 배아발생률은 BPA 농도가 높을수록 유의적인 감소를 나타냈으며, 800 ppb 농도부터 유의적인 감소를 보였다. 정상배아발생에 대한 독성값은 반수영향농도 ($EC_{50}$) 1056.1 ppb, 95% Cl 981.8~1163.9 ppb로 나타났다. 또한 무영향농도 (NOEC)와 최소영향농도(LOEC)는 500 ppb 및 800 ppb로 나타났다. BPA에 노출된 배아는 농도가 증가함에 따라 발생이 정체되는 현상이 나타났다. BPA에 노출된 pluteus 유생을 이용한 glutathione-S-transferase (GST) 유전자의 발현을 비교해본 결과 GST 유전자의 발현은 농도가 증가함에 따라 발현이 증가하였다. 본 연구 결과, 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 초기 배아 발생 과정 중 800 ppb 이상에서 독성을 나타냈으며 GST 유전자는 BPA 노출에 따른 위해성 평가에 생체지표유전자로 유용하게 이용될 수 있다고 생각된다.
본 연구는 시험생물로서 말똥성게 (Hemicentrotus pulcherrimus)를 이용하여 내분비계장애물질인 bisphenol A(BPA)의 독성 및 시험생물로서의 적합성 등을 조사하였다. 말똥성게(H. pulcherrimus)의 수정 및 정상 배아발생에 미치는 BPA의 독성을 보기 위하여 농도(0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb)에서 조사하였다. BPA 노출 시 수정률은 시험구간 내의 BPA 처리농도와 관계없이 유의적인 변화가 없었다. 정상 배아발생률은 BPA 농도가 높을수록 유의적인 감소를 나타냈으며, 800 ppb 농도부터 유의적인 감소를 보였다. 정상배아발생에 대한 독성값은 반수영향농도 ($EC_{50}$) 1056.1 ppb, 95% Cl 981.8~1163.9 ppb로 나타났다. 또한 무영향농도 (NOEC)와 최소영향농도(LOEC)는 500 ppb 및 800 ppb로 나타났다. BPA에 노출된 배아는 농도가 증가함에 따라 발생이 정체되는 현상이 나타났다. BPA에 노출된 pluteus 유생을 이용한 glutathione-S-transferase (GST) 유전자의 발현을 비교해본 결과 GST 유전자의 발현은 농도가 증가함에 따라 발현이 증가하였다. 본 연구 결과, 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 초기 배아 발생 과정 중 800 ppb 이상에서 독성을 나타냈으며 GST 유전자는 BPA 노출에 따른 위해성 평가에 생체지표유전자로 유용하게 이용될 수 있다고 생각된다.
In this study, gametotoxicity and embryotoxicity experiments using Hemicentrotus pulcherrimus were carried out to investigate the ecotoxicological effects of bisphenol A (BPA). We examined the effects of BPA on fertilization and normal embryogenesis at various concentrations (0, 300, 500, 800, 1000,...
In this study, gametotoxicity and embryotoxicity experiments using Hemicentrotus pulcherrimus were carried out to investigate the ecotoxicological effects of bisphenol A (BPA). We examined the effects of BPA on fertilization and normal embryogenesis at various concentrations (0, 300, 500, 800, 1000, and 1500 ppb). The results demonstrated that the fertilization rates were not changed. The normal embryogenesis rates were gradually decreased in a dose-dependent manner, and were significantly lowered following 800 ppb BPA treatment ($EC_{50}$=1056.1 ppb, 95% Cl=981.8~1163.9 ppb). The observed effective concentration and the lowest observed effective concentration of the normal embryogenesis rate were 500 ppb and 800 ppb, respectively. The embryos showed retarded development at each tested concentration, indicating the fact the embryonic development was delayed due to the increasing concentrations of BPA. Furthermore, we examined the expression of glutathione S-transferase (GST) mRNA at various concentrations of BPA in H. pulcherrimus. Interestingly, it was found that the expression level of GST mRNA was significantly increased in the experimental group exposed to BPA. Based on these results, we suggested that BPA at greater than 800 ppb has a toxic effect during the early embryonic stages of H. pulcherrimus, and GST mRNA may be used as a biomarker for risk assessment of BPA contamination.
In this study, gametotoxicity and embryotoxicity experiments using Hemicentrotus pulcherrimus were carried out to investigate the ecotoxicological effects of bisphenol A (BPA). We examined the effects of BPA on fertilization and normal embryogenesis at various concentrations (0, 300, 500, 800, 1000, and 1500 ppb). The results demonstrated that the fertilization rates were not changed. The normal embryogenesis rates were gradually decreased in a dose-dependent manner, and were significantly lowered following 800 ppb BPA treatment ($EC_{50}$=1056.1 ppb, 95% Cl=981.8~1163.9 ppb). The observed effective concentration and the lowest observed effective concentration of the normal embryogenesis rate were 500 ppb and 800 ppb, respectively. The embryos showed retarded development at each tested concentration, indicating the fact the embryonic development was delayed due to the increasing concentrations of BPA. Furthermore, we examined the expression of glutathione S-transferase (GST) mRNA at various concentrations of BPA in H. pulcherrimus. Interestingly, it was found that the expression level of GST mRNA was significantly increased in the experimental group exposed to BPA. Based on these results, we suggested that BPA at greater than 800 ppb has a toxic effect during the early embryonic stages of H. pulcherrimus, and GST mRNA may be used as a biomarker for risk assessment of BPA contamination.
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문제 정의
본 연구는 BPA의 오염이 해양생태계에 미치는 영향을 말똥성게(Hemicentrotus pulcherrimus)를 이용하여 정상적인 수정률 및 배아 발생률을 이용하여 평가하며, 또한 생체지표유전자로서 GST 유전자를 선택하여 GST의 상대적인 발현 양상을 관찰하여 평가하고자 한다.
제안 방법
)를 이용하여 최종 반응용액 20 μL로 시행하였다. GST의 PCR 반응조건은 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 28회 반복하였으며, internal control인 SpZ12-1의 PCR 반응조건은 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 25회 반복하였다. RT-PCR은 제조사인 바이오니아의 방법에 따라 시행하였다.
RT-PCR은 제조사인 바이오니아의 방법에 따라 시행하였다. RT-PCR 산물은 2% 아가로즈겔 전기영동을 통해 확인하였으며 band intensity는 Gel DocTM XR+ System (Bio-Rad)을 이용하여 분석하였다.
cDNA합성을 위한 역전사 반응(Reverse Transcription, RT)은 1 μg의 total RNA, oligodT18 (0.5 μg)와 AccuPower RT premix (Bioneer Co.)를 이용하여 최종 반응용액 20 μL로 42°C에서 1시간 시행하였다.
각각의 BPA 농도에 30분간 노출시킨 정자와 정상 난자를 인공수정을 시켰다. 인공수정 10분 경과 후 수정률을 관찰하였으며, 배아발생은 인공수정 후 pluteus 유생 시기인 64시간째에 관찰하였다(Pagono et al.
대조구 및 각 실험구의 수정 후 64시간째인 pluteus 유생을 RNAiso Plus (TaKaRa Co.)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출 방법은 제조사의 방법에 따라 시행하였다.
Louis, MO) 제품을 사용하였으며, 멸균해수를 이용하여 stock solution (1 ppm)을 준비하여 사용하였다. 말똥성게(H. pulcherrimus)의 정상적인 수정률 및 배아 발생률을 조사하기 위한 실험 농도는 각각 BPA 농도(0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb)로 설정하여 노출시켰다.
모든 실험은 100개 이상의 배아를 3회 반복 계수하여, 전체배아에서 정상배아 수의 백분율을 산출하였으며, 이런 실험과정을 3회 반복 실시하였다. 이러한 연구결과를 바탕으로 probit 통계법을 이용하여 반수영향농도(50% Effective Concentration, EC50) 및 95% 신뢰구간(95% Confidence Limit, 95% Cl)을 분석하였다.
이때 생식공은 배양액에 충분히 잠기게 하였다. 수집한 생식세포 중에서 정자는 1회, 난자는 3회 세정한 후에 실험에 이용하였다.
시험생물을 수용한 수조환경 및 수온은 자연채광 상태의 유수식 환경이며 9±1℃의 온도를 설정하였다.
모든 실험은 100개 이상의 배아를 3회 반복 계수하여, 전체배아에서 정상배아 수의 백분율을 산출하였으며, 이런 실험과정을 3회 반복 실시하였다. 이러한 연구결과를 바탕으로 probit 통계법을 이용하여 반수영향농도(50% Effective Concentration, EC50) 및 95% 신뢰구간(95% Confidence Limit, 95% Cl)을 분석하였다. 또한, Dunnett’s test 분석법을 이용하여 무영향농도(No Observed Effective Concentration, NOEC)와 최소영향농도(Lowest Observed Effective Concentration, LOEC)를 분석하였다.
각각의 BPA 농도에 30분간 노출시킨 정자와 정상 난자를 인공수정을 시켰다. 인공수정 10분 경과 후 수정률을 관찰하였으며, 배아발생은 인공수정 후 pluteus 유생 시기인 64시간째에 관찰하였다(Pagono et al. 1985a, b) (Fig. 1).
중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 RT를 통해 얻은 cDNA 1 μL와 GST프라이머 forward (5′-TTCGTGGCTGAGGTATTTGC-3′), reverse (5′-TTGATATTTCCTTGCCGCAG-3′) SpZ12-1 프라이머 forward (5′-AAAATGACACAGGCGATGGA-3′), reverse (5′-TAATGTTTCTCGCTCCCCCT-3′) 및 AccuPower HotStart PCR premix (Bioneer Co.)를 이용하여 최종 반응용액 20 μL로 시행하였다.
대상 데이터
BPA (Bisphenol A; 4,4′-isopropylidenediphenol)는 Sigma (St. Louis, MO) 제품을 사용하였으며, 멸균해수를 이용하여 stock solution (1 ppm)을 준비하여 사용하였다.
말똥성게(H. pulcherrimus)의 표면을 멸균해수로 세척 하여 성게표면의 이물질을 제거한 후, 실험에 이용하였다. 성게는 암컷 및 수컷 각 6개체로 크기는 대략 직경 3.
본 연구는 2014년도 국립수산과학원 경상과제연구비 지원으로 국립수산과학원 서해수산연구소 해양생태위해 평가센터에서 수행하였다.
1986). 본 연구에서는 성게 중에서 우리해역에 많이 서식하는 말똥성게(H. pulcherrimus)를 시험종으로 선정하였다.
pulcherrimus)의 표면을 멸균해수로 세척 하여 성게표면의 이물질을 제거한 후, 실험에 이용하였다. 성게는 암컷 및 수컷 각 6개체로 크기는 대략 직경 3.5 cm 이상을 선별하여 사용하였다. 배양액은 자연해수를 membrane filter (pore size 0.
시험생물 말똥성게(H. pulcherrimus)는 2014년 3월에 전라북도 부안군에 위치한 격포리 인근 해안에서 채집 하였다. 채집한 시험생물은 저온상태에서 이송하여 본 연구소 해양생물배양실에서 1주간 순치한 후에 평가연구에 사용하였다.
pulcherrimus)는 2014년 3월에 전라북도 부안군에 위치한 격포리 인근 해안에서 채집 하였다. 채집한 시험생물은 저온상태에서 이송하여 본 연구소 해양생물배양실에서 1주간 순치한 후에 평가연구에 사용하였다. 시험생물을 수용한 수조환경 및 수온은 자연채광 상태의 유수식 환경이며 9±1℃의 온도를 설정하였다.
데이터처리
연구결과의 유의성 검정은 Student’s t-test로 하였으며, p가 0.05 이하인 것을 유의한 것으로 결정하였다.
이론/모형
GST의 PCR 반응조건은 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 28회 반복하였으며, internal control인 SpZ12-1의 PCR 반응조건은 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 25회 반복하였다. RT-PCR은 제조사인 바이오니아의 방법에 따라 시행하였다. RT-PCR 산물은 2% 아가로즈겔 전기영동을 통해 확인하였으며 band intensity는 Gel DocTM XR+ System (Bio-Rad)을 이용하여 분석하였다.
또한, Dunnett’s test 분석법을 이용하여 무영향농도(No Observed Effective Concentration, NOEC)와 최소영향농도(Lowest Observed Effective Concentration, LOEC)를 분석하였다.
)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출 방법은 제조사의 방법에 따라 시행하였다. 추출한 total RNA는 spectrophotometer (NanoVue, GE Healthcare)를 이용하여 정량 하였다.
성능/효과
3). BPA를 처리한 후배아의 발생에서 특이한 점은 고농도의 BPA에 노출된 배아에서의 발생이 대조구나 저농도에 비해 느려지는 현상이 발견되었다. 800 및 1000 ppb 농도에서는 pluteus 유생의 전단계인 프리즘 단계의 배아가 존재하였다(Fig.
BPA에 노출된 말똥성게(H. pulcherrimus)의 pluteus 유생에서의 GST 유전자의 발현은 대조구에 비해 농도가 높을수록 GST 유전자의 발현은 유의적으로 높게 발현되었다. BPA 처리 농도간의 발현 양상은 300 ppb에서 1000 ppb 농도까지는 800 ppb에서 상대적으로 조금 낮은 발현 양상을 보였다.
2). 그러나 정상배아 발생률은 BPA 농도가 높을수록 정상배아발생은 유의적으로 낮아지는 결과를 나타냈다 (Fig. 3). 연구 결과 BPA는 성게 배아의 발생과정에 민감하게 반응하여 정상적인 배아 발생을 저해시키는 것을 알 수 있다.
pulcherrimus)의 유생에게 미치는 최소영향농도 800 ppb를 초과할 경우 연안 생태계 내에 서식하는 다른 해양생물의 서식 및 자손의 정상적인 생산에 있어서도 악영향을 미칠 수 있으며, 이러한 환경의 개선이 이루어지지 않으면 해양생태계내의 종 및 개체수의 감소를 초래할 수 있다. 또한 해양생태계 위해성 평가의 시험생물로 말똥성게 (H. pulcherrimus)는 유용하다고 판단되며, GST 유전자는 생체지표유전자로서 내분비계장애물질인 BPA의 오염정도를 판단하는 데 유용하게 이용할 수 있다고 생각된다.
본 연구 결과 BPA에 노출시킨 정자와 노출시키지 않은 난자와의 인공수정 시 수정률은 대조구와 비교하여 유의적인 차이가 나타나지 않았다(Fig. 2). 그러나 정상배아 발생률은 BPA 농도가 높을수록 정상배아발생은 유의적으로 낮아지는 결과를 나타냈다 (Fig.
2012). 본 연구 결과에서 BPA 농도 300 ppb에서부터 GST 유전자의 유의적인증가를 볼 수 있다. 따라서 BPA는 말똥성게(H.
본 연구결과 BPA가 연안 해역에 유입되어 말똥성게 (H. pulcherrimus)의 유생에게 미치는 최소영향농도 800 ppb를 초과할 경우 연안 생태계 내에 서식하는 다른 해양생물의 서식 및 자손의 정상적인 생산에 있어서도 악영향을 미칠 수 있으며, 이러한 환경의 개선이 이루어지지 않으면 해양생태계내의 종 및 개체수의 감소를 초래할 수 있다. 또한 해양생태계 위해성 평가의 시험생물로 말똥성게 (H.
3). 연구 결과 BPA는 성게 배아의 발생과정에 민감하게 반응하여 정상적인 배아 발생을 저해시키는 것을 알 수 있다. 본 연구 결과와 유사한 이전의 연구 보고는 성게(Paracentrotus lividus)를 이용한 연구 결과이다 (Ozlem and Hatice 2008).
5). 연구결과를 바탕으로 말똥성게(H. pulcherrimus)의 배아 발생률에 대한 BPA의 독성값을 살펴보면 EC50는 1056.1 ppb 를 나타냈고, EC50에 대한 95% Cl은 981.8~1163.9 ppb 를 나타냈다. 정상배아 발생률에 대한 NOEC는 500 ppb 로 나타났고, LOEC는 800 ppb로 나타났다(Table 2).
정상 난자와 각각의 BPA (0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb) 농도에 노출된 정자와의 인공수정 시 pluteus 유생 시기에 나타난 정상적인 배아의 발생률은 대조군 및 각각의 처리 농도군 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb에서 각각 95%, 94%, 92%, 84%, 63% 및 0%를 나타내었으며, BPA 처리농도가 높을수록 정상배아발생율은 유의적으로 낮아지는 경향을 나타냈다. 특히 1500 ppb의 고농도에서는 모든 배아가 치사하였다(Fig.
정상 난자와 각각의 BPA (0, 300, 500, 800, 1000, 1500 ppb) 농도에 노출된 정자와의 인공수정 시 수정률은 정자에 처리한 BPA의 처리 농도에 따른 유의적인 차이가 나타나지 않았다(Fig. 2).
정상배아 발생률은 BPA 농도 증가에 따라 표준독성반응으로 잘 알려진 S자형 곡선을 나타냈다(Fig. 5). 연구결과를 바탕으로 말똥성게(H.
후속연구
2010). 따라서 말똥성게(H. pulcherrimus)의 배아도 초기 배아발생단계에서 성장자극 축이 BPA에 영향을 받아 발생이 지연되리라 생각된다. BPA는 수생생물의 항산화 방어와 산화 스트레스를 유도한다고 알려져 있으며 물 벼룩(D.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Bisphenol A는 어디에 사용됩니까?
산업화 및 인간생활의 편의를 위해 개발 및 사용되는 다양한 화학물질들이 환경에 노출되어짐에 따라 인간 및 야생동물의 체내 및 내분비계에 직, 간접적으로 많은 영향을 미친다. Bisphenol A (BPA)는 캔의 코팅재료인 에폭시(epoxy), 음식용기 및 포장재로 쓰이는 폴리카보네이트(polycarbonate) 등의 플라스틱 제조의 원료로 사용되며, 화장품의 항균제 및 곰팡이 제거제, 젖병 및 치과치료용 봉합제로 사용된다(Brotons 1995; Tyl et al. 2002).
내분비계 장애물질인 Bisphenol A는, 어떻게 인체의 생리 작용을 교란시키나?
2002). BPA는 에스트로겐성 화합물로서 내분비계장애물질(Endocrine Disruptor Chemicals, EDCs)로 분류되며 에스트로겐 수용체에 대한 친화도가 높아 에스트로겐 수용체와의 결합을 통해 생체 내 에스트로겐과 유사한 생리학적 효과를 일으켜서 체내 내분기계 기관의 생리 작용을 교란시킨다는 보고가 있다. 특히 BPA의 노출에 따른 계속된 축적은 수컷 생식기계(reproductive system)의 여성화, 조기성숙 및 암컷의 조기 사춘기 도래 등을 일으킨다(Herman-Giddens et al.
GST(Glutathione S-transferase)는 어떤 기능이 있습니까?
2004). GST는 비생체물질(xenobiotic), 중금속(heavy metal), 병원체(pathogen) 및 산화스트레스(oxidative stress) 등을 포함한 생물 및 비 생물적 스트레스로부터 세포를 보호하는 기능을 가진다 (Kampranis et al. 2000; Mueller et al.
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