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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 효능을 획기적으로 증대시키고 응용성을 넓이기 위해서 순수한 콘드로이틴황산을 분리하여 제조하였으며 그의 특성에 대하여 연구하였다.
제안 방법
- 반응하여 얻은 콘드로이틴황산 올리고당 환원말단을 2-aminopyridine으로 발색시키고 겔 투과 크로마토그래피를 행하였다. GPC(Wares사 516)는 실온에서 행하였고 이동상은 0.
- 추출되어진 형태 그대로 사용되고 있다. 본 연구에서는 콘드로이틴/단백질 혼합 추출물로부터 콘드로이틴 황산만 순수하게 분리하였으며 그 결과는 다음과 같다.
- 물을 첨가하면서 여과막에 공급하였다. 사용한 한외여과 막은 콘드로이틴황산의 분자량을 고려하여 사용하였으며 상어연골에서 추출한 콘드로이틴황산의 분자량이 2 만 Da이상이기 때문에 분획분자량 2만인 한외여과 막을 사용하였으며 한외여 과막의 내압성을 고려하여 공급량을 선택하였다. 평균압력 2~3kg/ctif의 압력과 10L/분의 조건으로 그림 6과 같이 처리하였다.
- 상어연골 추출물에 침전제로서 5% CPC, 2% CaCb, 2% PEG 및 80% IPA를 각각 소정량 첨가하여 1시간 정도 방치하여 분별침전을 행하였다. 표 5와 같이 분리된 침전물은 L400G, 30분간 원심분리한 후 침전물의 수율을 측정하였다.
- 상어연골에 대해서는 알카라제에 의한 제조가 가장 효과적이고 경제적인 방법으로 나타났으므로, 알카라제에서의 콘드로이틴황산 소재 제조의 최적조건(pH, 효 소농온도)을 조사하여 상어연골로부터 콘드로이틴황산 소재를 각각 제조하였다. 즉, 소정량의 상어연골 분말에 2%(v/w, dry basis)의 알카라제를 첨가하고 60℃, pH 7.
- 상어연골을 파쇄하여 전처리로 산처리를 실시하였으며 전처리된 상어연골을 여러가지 조건에서 추출하였다.
- 시료의 금속함량은 적당량의 시료를 완전히 건조시킨 뒤 11(TC에서 24시간 산 가수분해한 다음, 일정량을 취하여 유도결합플라즈마방출분광기 (ICP Atomic Emission Spectrometer, Thermo Jallell Ash ICP-IRIS)를 사용하여 정량하였다.
- 5ml를첨가하여 희석시키고 질소로 치환하여 10CTC에서 2시간 가수분해하여 시험용액으로 사용하였다 . 시험용액 0.2ml 에 4% TCA용액 3.8ml 및 BaCl2-gelatin 시약(증류수에 gelatin 2g을 넣어 녹인 후 2~3시간 방치 후 사용) 1ml를첨가하여 교반하고 20분간 방치한 후 360nm에서 흡광도를 측정하여 황산기 함량을 정량하였다. 콘드로이틴황산의 함량은 황산기의 분자량과 콘드로이틴황산의 분자량과의 비로 구해지는 계수를 측정된 황산기의 함량에 곱하여 구하였다.
- 아미노산은 일정량의 시료를 정확히 칭량한 뒤 litre 에서 24시간 산 가수분해한 것을 시액으로 하였으며, 시액 일정량을 취하여 아미노산 분석기 (Amino Acid Analyzer, Pharmacia Biotech Biochrom 20)를 사용하여 정량하였다
- 즉, 효소분해 추출한 추출물을 여과하여 얻어진 불용 잔사와 원 시료의 무게 차를 구함으로써 추출물의 양을 구하여 추출 전 .후 시료의 무게 백분율로써 추출물의 수율을 나타내었다.
- 8ml 및 BaCl2-gelatin 시약(증류수에 gelatin 2g을 넣어 녹인 후 2~3시간 방치 후 사용) 1ml를첨가하여 교반하고 20분간 방치한 후 360nm에서 흡광도를 측정하여 황산기 함량을 정량하였다. 콘드로이틴황산의 함량은 황산기의 분자량과 콘드로이틴황산의 분자량과의 비로 구해지는 계수를 측정된 황산기의 함량에 곱하여 구하였다. 표준 검량선은 K2SO4로 작성하였다.
- 방치하여 분별침전을 행하였다. 표 5와 같이 분리된 침전물은 L400G, 30분간 원심분리한 후 침전물의 수율을 측정하였다. 그 결과, 80% IPA를 첨가하였을 때가 수율이 55.
- 표 6을 보면 콘드로이틴황산의 분리를 위한 용매 분별침전에서 가장 효과적인 침전제로 나타난 IPA를 농도별로 첨가하여, 첨가농도별 침전물의 수율 및 콘드로이틴황산의 함량을 측정하였다. 그 결과, 30~50%까지 첨가했을 경우는 40% 미만의 낮은 수율을 보였으므로 콘드로이틴황산 함량의 고려대상에서 제외하였으며, IPA 80% 이상 첨가 시 침전물의 수율은 60% 내외로 높아졌으며 콘드로이틴황산의 함량도 55% 이상의 높은 값을 보였다.
- 한외여과 처리하기 위하여 한외여과막(분획분자량 2 만 이하)을 장착한 한외여과장치에 싱기의 단백질 분해효소 처리액을 평균 2~3kg/cnf의 압력으로 처리하여 10 //분으로 처리 이송하여 단백질분해물을 분리하였다.
대상 데이터
- 상어연골은 인도네시아에서 수입하여 사용하였으며 단백질분해효소인 알카라제 및 콘드로이틴 분해효소인콘드로이틴아제는 Junsei사제를 구입하여 사용하였고 유도 결 합플라즈마방출분굉기 (ICP Atomic Emission Spectrometer, Thermo Jallell Ash ICP-IRIS)을 사용하였다. UV/Vis 분광광도계는 일본분광사제를 사용하였으며, GPC는 Waters사의 것을 사용하였다.
- 콘드로이틴황산의 함량은 황산기의 분자량과 콘드로이틴황산의 분자량과의 비로 구해지는 계수를 측정된 황산기의 함량에 곱하여 구하였다. 표준 검량선은 K2SO4로 작성하였다.
이론/모형
- 사용하였다. UV/Vis 분광광도계는 일본분광사제를 사용하였으며, GPC는 Waters사의 것을 사용하였다. 기타 시약 및 기구는 구입한 그대로 사용하였다.
- 일반성분은 상법(常法)에 따라 측정하였다. 즉, 수분은 상압 가열건조법, 조지방은 Soxhlet 법, 조단백질은 Kjeldahl법, 회분은 건식회화법으로 각각 측정하였다.
- 일반성분은 상법(常法)에 따라 측정하였다. 즉, 수분은 상압 가열건조법, 조지방은 Soxhlet 법, 조단백질은 Kjeldahl법, 회분은 건식회화법으로 각각 측정하였다.
성능/효과
- 1. 상어연골에서 추출한 콘드로이틴황산의 함량을 측정한 결과, 94.8%의 수율을 보였으며 이때의 콘드로이틴황산의 함량은 16.3%였으며 산처리를 한 경우에는 다당의 함량이 28.3%으로 무처리에 비하여 상당히 많은 함량을 나타내고 있다. 상어 연골을 산으로 처리하여 추출하는 것이 수율이나 형상에서 좋은 결과를 나타내었으며 또한 알칼리 처리에 의해 추출하는 것보다 효소에 의해 추출하는 것이 용액의 갈변을 막고 양질의 콘드로이틴황산을 추출할 수 있었다.
- 2. 상어연골 추출물을 한외여과 한 결과 각 stage에서 콘드로이틴황산의 유출액이 매우 작고 콘드로이틴황산의 추출액의 순도는 추출 전에 28%이었던 것을 98%까지 얻을 수 있었다. GPC 측정결과 콘드로이틴황산의 평균분자량은 27만Da이었다.
- 표 1. 2에서 보는 바와 같이 등뼈 및 어깨뼈의 수분함량은 10%이내 즉 7.5% 수준이었으며 다당의 함량은 산으로 처리하지 않은 경우 등뼈는 10.9%, 어깨뼈의 경우는 17.8%로 어깨뼈 내지 머리뼈에 더 많은 다 당이 함유되어 있음을 알 수 있었으며 산처리를 한 경우에는 다당의 함량이 23.9%, 28.3%으로 무처리에 비하여 상당히 많은 함량을 나타내고 있다. 따라서 콘드로이틴 황산을 산업적으로 추출할 경우 전처리로 산처리를하는 것이 경제적인 생산방법이 될 것으로 판단된다.
- 상어연골 추출물을 한외여과 한 결과 각 stage에서 콘드로이틴황산의 유출액이 매우 작고 콘드로이틴황산의 추출액의 순도는 추출 전에 28%이었던 것을 98%까지 얻을 수 있었다. GPC 측정결과 콘드로이틴황산의 평균분자량은 27만Da이었다.
- 함량을 측정하였다. 그 결과, 30~50%까지 첨가했을 경우는 40% 미만의 낮은 수율을 보였으므로 콘드로이틴황산 함량의 고려대상에서 제외하였으며, IPA 80% 이상 첨가 시 침전물의 수율은 60% 내외로 높아졌으며 콘드로이틴황산의 함량도 55% 이상의 높은 값을 보였다. 특히 IPA 90%에서는 수율과 콘드로이틴황산의 함량은 가장 높은 것으로 나타났는데 수율은 64.
- 표 5와 같이 분리된 침전물은 L400G, 30분간 원심분리한 후 침전물의 수율을 측정하였다. 그 결과, 80% IPA를 첨가하였을 때가 수율이 55.8%로 가장 높았고 5% CPC는 27.4%였다. 그러나, 2% CaCb와 2% PEG에서는 1% 내외의 매우 낮은 수율을 보였다.
- 측정하여 표 4에 나타내었다. 그 결과, 등뼈와 어깨뼈 모두 Ca, P 및 Mg의 함량이 많았는데, Ca가 등뼈 및 어깨뼈에서 각각 7.5% 및 3.1%였고, 1* 4.1% 및 1.6%, Mge 등뼈와 어깨뼈 모두 0.1% 정도였다. 다음으로 Fe, Zn 및 Mn의 순으로 많았으며 인체에 유해한 중금속인 Cd와 Hg 등은 검출되지 않았고 Pbe 허용 기준치(2ppm) 미만인 극미량 검출되어 식용에는 문제가 없는 것으로 나타났다.
- 그 결과, 등뼈의 경우 산성아미노산인 aspartic acid와 glutamic acid의 함량이 각각 23.5mg/100g 와 44.0mg/100g로 나타났으며 glycinee 65.2mg/100g, Prolinee 44.1mg/100g 등으로 나타났고 그 함량은 다른 해양성 동물보다 낮은 함량을 나타내었다.
- 그림 1 에는 16~24시간 동안 수율 및 콘드로이틴황산의 함량을 측정하였다. 그 결과, 반응시간에 따라 수율은 점차 증가하다가 반응 20시간에서 82.8% 의 가장 높은 수율을 보였으며 이때의 콘드로이틴황산의 함량은 16.3%였다. 또한, 콘드로이틴황산은 반응시간에 따른 큰 변화 없이 액체로 16~17%의 함량을 보였다.
- 가수분해 한 결과를 그림 2에 나타내었다. 그 결과, 반응시간에 따라 수율은 점차 증가하다가 반응 20시간에서 86.0%의 가장 높은 수율을 보였으며 이때의 콘드로이틴황산의 함량은 16.3%였다. 또한, 콘드로이틴황산은 반응시간에 따라 큰 변화 없이 액체로 16~17.
- 그 결과, 반응시간에 따라 수율은 점차 증가하다가 반응 3시간에서 96.0%의 가장 높은 수율을 보였으며 이때의 콘드로이틴황산의 함량은 27.3%였다. 또한, 콘드로이틴황산은 반응시간 2시간부터는 반응시간에 따른 큰 변화 없이 액체로 27~28.
- 그러나, 2% CaCb와 2% PEG에서는 1% 내외의 매우 낮은 수율을 보였다. 그러므로, 시험한 침전제 중에서는 IPA가 가장 효과적인 침전제로 나타났다.
- 1% 정도였다. 다음으로 Fe, Zn 및 Mn의 순으로 많았으며 인체에 유해한 중금속인 Cd와 Hg 등은 검출되지 않았고 Pbe 허용 기준치(2ppm) 미만인 극미량 검출되어 식용에는 문제가 없는 것으로 나타났다.
- 또한 어깨뼈를 대상으로 1% 염산용액으로 처리하여탈칼슘한 후 10배 가량의 물을 가한 다음 2%의 알카라제를 넣고 24시간 추출한 결과를 그림 1에 나타내었다 반응시간에 따른 수율 및 콘드로이틴황산의 함량을 측정한 결과, 반응시간에 따라 수율은 점차 증가하다가 반응 20 시간에서 94.8%의 가장 높은 수율을 보였으며 이때의 콘드로이틴황산의 함량은 26.3%였다. 또한, 콘드로이틴황산은 반응시간 12시간부터는 반응시간에 따른 큰 변화 없이 액체로 26~28%의 함량을 보였다.
- 3%였다. 또한, 콘드로이틴황산은 반응시간 12시간부터는 반응시간에 따른 큰 변화 없이 액체로 26~28%의 함량을 보였다.
- 3%였다. 또한, 콘드로이틴황산은 반응시간 2시간부터는 반응시간에 따른 큰 변화 없이 액체로 27~28.5%의 함량을 보였다.
- 3%였다. 또한, 콘드로이틴황산은 반응시간에 따른 큰 변화 없이 액체로 16~17%의 함량을 보였다.
- 막분리 전후 콘드로이틴황산의 GPC 분석결과 그림 7 에서 보는 바와 같이 한외여과 전의 상어연골 추출물은 콘드로이틴황산과 효소에 의해 분해된 펩타이드가 분리되어 나오는 것을 볼 수 있으며 한외여과 한 후 stage 3에서 얻어진 시료에서는 펩타이드가 정제되고 순수한 콘드로이틴황산만이 나타남을 알 수 있다. 이로부터 한외여과에 의해 순수한 콘드로이틴황산을 얻을 수 있음을 알 수 있고 이때 콘드로이틴황산의 분자량은 중량평균 분자량으로 약 27만이었다.
- 3%으로 무처리에 비하여 상당히 많은 함량을 나타내고 있다. 상어 연골을 산으로 처리하여 추출하는 것이 수율이나 형상에서 좋은 결과를 나타내었으며 또한 알칼리 처리에 의해 추출하는 것보다 효소에 의해 추출하는 것이 용액의 갈변을 막고 양질의 콘드로이틴황산을 추출할 수 있었다.
- 이러한 결과로부터 상어연골을 산으로 처리한 후에 알칼리 또는 효소에 의해 추출하는 것이 수율이나 형상에서 좋은 결과를 나타내었으며 또한 알칼리 처리에 의해 추출하는 것보다 효소에 의해 추출하는 것이 용액의 갈변을 막고 양질의 콘드로이틴황산을 추출할 수 있었다.
- 그 결과, 30~50%까지 첨가했을 경우는 40% 미만의 낮은 수율을 보였으므로 콘드로이틴황산 함량의 고려대상에서 제외하였으며, IPA 80% 이상 첨가 시 침전물의 수율은 60% 내외로 높아졌으며 콘드로이틴황산의 함량도 55% 이상의 높은 값을 보였다. 특히 IPA 90%에서는 수율과 콘드로이틴황산의 함량은 가장 높은 것으로 나타났는데 수율은 64.6%였고, 콘드로이틴황산은 66.5%로 나타났다.
- 표 7에서 보는 바와 같이 각 stage에서 콘드로이틴황산의 유출액이 매우 작고 콘드로이틴황산의 추출액의 순도는 추출 전에 28%이었던 것을 98%까지 얻을 수 있었다.
후속연구
- 3%으로 무처리에 비하여 상당히 많은 함량을 나타내고 있다. 따라서 콘드로이틴 황산을 산업적으로 추출할 경우 전처리로 산처리를하는 것이 경제적인 생산방법이 될 것으로 판단된다.
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