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문제 정의
- 이 뿐만 아니라 lumazine protein 유전자와 riboflavin synthase 유전자는 lux operon 영역의 상류와 하류에 각각 존재 하며 서로 반대 방향으로 전사될 것으로 사료되어 생화학적으로 나 분자유전학적 측면에서 흥미를 유발시키고 있다(11). 따라서 본 단보에서는 저자의 전의 연구(9, 26)에 의하여 lux operon의 하류 영역에서 riboflavin 생합성에 관여하는 유전자들이 존재하는 것으로 알려진 P. phosphoreum NCMB844에서 lumazine proteine 코드 하는 유전자에 대한 염기서열 분석 및 PCR을 통한 아미노-말단 절반만을 가진 유전자를 제조하여 대장균에서의 발현 양상을 조사하여 보았다.
제안 방법
- P. phosphoreum lumP 유전자만을 대장균에서 특정하게 발현시키기 위하여 P- phosphoreum lumP 유전자가 포함된 재조합 플라스미드 PplumP-N.pNCO과 PplumP-W.pNCO를 E. coli XL-1에 전이시킨 다음, 형질 전환체를 37℃에서 660 nm의 OD값이 0.6까지 되도록 배양한 다음, IPTG를 최종농도 1 mM 첨가한 후 4시간 더 배양시켰다.
- 최종 혼합물 50 (11에는 polymerase를 위한 표준 완충용액에 50 pmol의 프라이머들, 300 ng의 주형 DNA로 쓰여진 재조합 플라스미드 PpEE. pT7-5 (11), 각각의 농도가 L25 mM인 4 종류의 dNTP, 그리고 0.25 U의 Vent DNA polymerase (New England Biolabs)가 첨가 되었다. 중합효소 연쇄반응은 자동 thermal cycler에서 95℃에서 1 분간의 변성, 55℃에서 1 분간의 복원, 그리고 7TC에서 1분 간의 신장 과정을 35회 반복하였다.
- phosphoreum 의 lumP 유전자의 아미노-말단 도메인 (Pp/wmP-N) 혹은 전체 lumP 유전자 (Pp/sP-W) 만을 포함하는 DNA 절편의 증폭은 다음과 같은 방법에 의하여 이루어졌다. 독일 MWG사에서 합성된 5'GGAGAAATTAACCATGrTCAAAG GrATTGTTCWumpl) 와 S'GTCCTGCACHTAACCTTTCCCAA GGAGrGATC3, (lump3) 혹은 5'GTCCTGCAGTTATAAAGGATC ATATTATATG3, (lump5)에 의한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 시켜 PCR 산물을 정제한 후, 제한 효소 인식부위를 만들기 위해 5' 말단에 EcoRI 인식 부위를 포함하고 있는 프라이머 ACACA GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATG (MF)와 제한효소 PstI 인식 부위를 지닌 위의 lump3 혹은 lump5 프라이머를 써서 다시 한 번 중합효소 연쇄 반응을 시켰다. 최종 혼합물 50 (11에는 polymerase를 위한 표준 완충용액에 50 pmol의 프라이머들, 300 ng의 주형 DNA로 쓰여진 재조합 플라스미드 PpEE.
- 또한 luniazine protein을 코드하는 lumP 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 아미노 말단 절반만을 포함하는 truncated lumP 및 전체 lumP 유전자를 포함하는 DNA 절편을 PCR 방법으로 증폭시 켜 보았다. PCR 증폭에서 얻은 DNA 조각을 1.
- 중합효소 연쇄반응은 자동 thermal cycler에서 95℃에서 1 분간의 변성, 55℃에서 1 분간의 복원, 그리고 7TC에서 1분 간의 신장 과정을 35회 반복하였다. 아미노-말단 lumP 유전자 혹은 전체 유전자를 포함하는 이 DNA 절편을 EcoRI과 FstI으 로 절단하여 같은 제한 효소로 절단된 벡터 pNCO113에 연결시켜 재조합 플라스미드 PpZwiF-N.pNCO 혹은 Pp/wmP-W.pNCO 를 제조하였다.
대상 데이터
- 본 연구 실험에 쓰여진 주요한 세균 균주들은 P. phosphoreim (NCMB844), Escherichia colt M15 등이며, 플라스미드로는 pNCO113 (25)이 cloning vector로 쓰였다. P.
- 제한효소, T4 DNA ligase, DNA polymerase의 Klenow fragmente- New England Biolab 혹은 Pharmacia에서 구입하였으며, 그 밖의 riboflavin, ampicillin, isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside (IFTG) 등은 Sigma 제품을 사용하였다.
이론/모형
- P. phosphoreum lumP 유전자의 DNA 염기 서열은 dideoxy chain termination 방법을 응용한 자동 염기서열 분석 장치에 의하여 결정되었다.
성능/효과
- 3에서는 여러 균주의 riboflavin synthase와 lumazine protein 혹은 yellow fluorescent protein과의 아미노산 상동성을 비교하였다. B. subtilis와 Photobacterium species의 riboflavin synthase는 45%의 아미노산 상동성이 있었 으며, Photobacterium species의 riboflavin synthase와 lumazine protein과는 30% 정도의 아미노산 상동성을 보였다. 또한 여러 Photobacterium species의 lumazine pnrteir으 자체적으로 상호간에 대략 80%의 아미노산 상동성을 보였으며, lumazine protein과 yellow fluorescent protein 그리고 riboflavin synthase와 yellow fluorescent proteine 각각 약 30%의 낮은 아미노산 상동성을 나타냈다.
- P. photobacterium의 lumP 유전자를 번역한 폴리펩타이드를 분석한 Fig. 3에서 보는 바와 같이 이미 발견된 다른 발광 박테리아의 lumazine protein에 비하여 약 15개의 아미노산이 많은 open reading frame으로 구성되어 있으며, codon usage를 분석한 결과 발광 박테리아에서 추출한 유전자가 E. coli에서 발현될 때의한 요소로 작용되는(11) E. coli에서의 사용빈도가 0.2%로 매우 낮게 나타나는 He를 코드하게 되는 AUA codon이 205 codon 중 6 번 나타나 2.9%의 매우 높은 출현 빈도를 보였으며, E. coli에서 전체 He의 codoil중 AUA codon이 약 2.8%가 나타나는 것으로 알려지고 있는데 lumazine protein 유전자에서는 40 %의 출현 빈도를 나타냈다. Fig.
- 또한 luniazine protein을 코드하는 lumP 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 아미노 말단 절반만을 포함하는 truncated lumP 및 전체 lumP 유전자를 포함하는 DNA 절편을 PCR 방법으로 증폭시 켜 보았다. PCR 증폭에서 얻은 DNA 조각을 1.2 %의 agarose gel에서 분석한 결과 287 및 615 bp의 크기를 갖는 DNA를 확인할 수 있었다(lanes 1 and 2 in Fig. 5). 이 DNA 조각을 에탄올 침전의 방법으로 세척시킨 다음 EcoRI와 Pstl 제한 효소로 절단하여, 같은 제한효소로 절단된 pNCO113 벡터에 연결시켜 재조합 플라스미드 PpZwmP-N.
- Riboflavin 생합성 유전자가 발견된 P. phosphoreum NCMB 844에서의 lumP 유전자에 대한 정보를 얻기 위해 저자의 전의 연구 결과(10, 11)에 의하여 lux 유전자의 클로닝 및 서열 분석에서 얻어진 lux operon을 포함하고 있는 DNA가 pT7 플라스미드에 삽입되어 있는 일련의 재조합 플라스미드를 조사한 결과, 그 중 pT7-5에 삽입되어 있는 P. phosphoreum의 HindHL-Bamtll DNA 절편 (PpHB.pT7-5 in Fig. 1A)는 luxC 상류로부터 약 2 kbp 정도까지 뻗쳐 있었다(Fig. IB). Lumazine protein 유전자가 luxC DNA 상류 영역으로부터 700여 bp 분리되어 있는 P.
- subtilis와 Photobacterium species의 riboflavin synthase는 45%의 아미노산 상동성이 있었 으며, Photobacterium species의 riboflavin synthase와 lumazine protein과는 30% 정도의 아미노산 상동성을 보였다. 또한 여러 Photobacterium species의 lumazine pnrteir으 자체적으로 상호간에 대략 80%의 아미노산 상동성을 보였으며, lumazine protein과 yellow fluorescent protein 그리고 riboflavin synthase와 yellow fluorescent proteine 각각 약 30%의 낮은 아미노산 상동성을 나타냈다. 그러나 Fig.
- Riboflavin synthase에 의하여 촉매 되는 반응은 효소와 기질인 두 분자의 lumazine 사이의 ternary complex의 형성이 관여되는 것으로 인식되고 있으며 두 도메인에 lumazine 결합 자리일 것으로 생각되는 consensus sequence/} 발견되었다(24). 본 연구에서 클로닝된 P. phosphoreitm의 lumazine protein 유전자로부터 번역된 단백질의 아미노산 서열을 분석한 Fig. 4에서 보는 바와 같이, riboflavin synthase의 경우와 유사하게 이 단백질의 아미노-말단과 카르복시-말단 도메인 간에 내부의 아미노산 상동성이 있음을 보였다. 아미노-말단과 카르복시-말단 간에 상동성을 보이는 아미노산들은 검정색 박스로 표기하였으며, 유사한 성질을 갖는 아미노산들은 회색 박스로 나타냈다.
후속연구
- 그러므로 riboflavin synthase 효소 활성도가 소실된 채로 형광을 띠게 되는 lumazine protein과 riboflavin synthase의 binding site 및 active site를 함께 비교하고 분석하는 것은 매우 중요하고 요긴하다. 따라서 본 논문에서 제시된 lumazine protein의 아미노산 서열 분석 및 발현에 관한 자료는, riboflavin synthase 혹은 lumazine protein의 단백질-단백질 상호작용 영역, riboflavin synthase와 lumazine protein에서 발색단과 결합하는 아미노산 등, 기능적으로 작용하는 특정 아미노산 잔기(들)을 동정하고자 하는 위치지정 돌연변이등과 같은 가까운 미래에 수행되어져야 할 실험의 기초 자료가 될 것이다.
- 대부분의 그램 음성세균들의 병원성 세균들은 비타민을 외부에서 얻을 수 없기 때문에 세균내의 생합성에 절대적인 의존성을 보이게 된다. 이러한 이유로 vitamin B의 생합성 경로는 화학 제재 항생제의 개발 가능성의 타깃으로써 지대한 관심을 끌고 있으며 (1) riboflavin 생합성 효소에 관한 연구는 항생활성도 (antibacterial activity)를 지닌 합리적인 효소 저해제의 출발점을 제시할 수 있을 것이다. 본 논문의 lumazine protein 및 다른 발광 박테리아에서 발견된 yellow fluorescent protein등은 gene duplication0]] 기인하여 파생된 riboflavin synthase의 superfamily 일 것으로 추리되고 있다.
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