서울시내 수계시설에서 분리된 Legionella spp.의 병원성에 대한 분자역학적 연관성 Molecular Epidemiological Relationship of the Pathogenicity of Legionella spp. Isolated from Water Systems in Seoul원문보기
레지오넬라균은 치명적인 폐렴을 일으킬 수 있는 균으로서, 기후 온난화와 함께 노출의 수위가 높아지고 있는 병원성균이다. 본 연구는 2008년 6월부터 8월까지 서울시내 25개구 소재 수계시설에서 분리한 레지오넬라균 73개 주에 대해 혈청형, Dot/Icm라 일컬어지는 병원성 유전자 분석 그리고 Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)를 실시하여 유전자형과 그들 사이의 상관관계를 파악하였다. 73개주 중 69주는 Legionella pneumophila로 혈청형의 분포는 sg1 43주, sg6 9주, sg5 8주, sg3 8주, sg2 1주로 파악되었으며, Legionella spp. 4개주는 Legionella nautarum였다. 분리된 Legionella pneumophila 대부분이 여러 개의 병원성 유전자를 보유하고 있었으며, 반면에 Legionella nautarum은 병원성 유전자가 많이 결핍되어있었다. PFGE pattern을 분석해 볼 때, Legionella pneumophila가 동일한 혈청형안에서 다양하게 분화되어감을 볼 수 있었으며, 병원성 유전자의 분포와 깊은 상관관계를 보였다.
레지오넬라균은 치명적인 폐렴을 일으킬 수 있는 균으로서, 기후 온난화와 함께 노출의 수위가 높아지고 있는 병원성균이다. 본 연구는 2008년 6월부터 8월까지 서울시내 25개구 소재 수계시설에서 분리한 레지오넬라균 73개 주에 대해 혈청형, Dot/Icm라 일컬어지는 병원성 유전자 분석 그리고 Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)를 실시하여 유전자형과 그들 사이의 상관관계를 파악하였다. 73개주 중 69주는 Legionella pneumophila로 혈청형의 분포는 sg1 43주, sg6 9주, sg5 8주, sg3 8주, sg2 1주로 파악되었으며, Legionella spp. 4개주는 Legionella nautarum였다. 분리된 Legionella pneumophila 대부분이 여러 개의 병원성 유전자를 보유하고 있었으며, 반면에 Legionella nautarum은 병원성 유전자가 많이 결핍되어있었다. PFGE pattern을 분석해 볼 때, Legionella pneumophila가 동일한 혈청형안에서 다양하게 분화되어감을 볼 수 있었으며, 병원성 유전자의 분포와 깊은 상관관계를 보였다.
Legionella spp. is the causative agent of Legionellosis, which induces a potentially fatal form of pneumonia. With a concentrated performance during the summer of 2008, we secured 73 isolates from the water systems of 25 wards in Seoul. We analysed serotypes, pathogenic genes (Dot/Icm), and patterns...
Legionella spp. is the causative agent of Legionellosis, which induces a potentially fatal form of pneumonia. With a concentrated performance during the summer of 2008, we secured 73 isolates from the water systems of 25 wards in Seoul. We analysed serotypes, pathogenic genes (Dot/Icm), and patterns of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) in an attempt to confirm relationships among them. Different from the previous year's pattern (2007), among the isolates, 69 were Legionella pneumophila and 4 were Legionella spp. The serotype distribution of Legionella pneumophila was sg1 43, sg6 9, sg5 8, sg3 8, and sg2 1. The serotype for the 4 Legionella spp. was Legionella nautarum. Most of the Legionella pneumophila had several pathogenic genes. On the other hand, the 4 Legionella spp. were defective in pathogenicity in genomic terms. The PFGE patterns of the serotypes showed a tendency for diversity of Legionella pneumophila and a close correlation with genetic pathogenicity.
Legionella spp. is the causative agent of Legionellosis, which induces a potentially fatal form of pneumonia. With a concentrated performance during the summer of 2008, we secured 73 isolates from the water systems of 25 wards in Seoul. We analysed serotypes, pathogenic genes (Dot/Icm), and patterns of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) in an attempt to confirm relationships among them. Different from the previous year's pattern (2007), among the isolates, 69 were Legionella pneumophila and 4 were Legionella spp. The serotype distribution of Legionella pneumophila was sg1 43, sg6 9, sg5 8, sg3 8, and sg2 1. The serotype for the 4 Legionella spp. was Legionella nautarum. Most of the Legionella pneumophila had several pathogenic genes. On the other hand, the 4 Legionella spp. were defective in pathogenicity in genomic terms. The PFGE patterns of the serotypes showed a tendency for diversity of Legionella pneumophila and a close correlation with genetic pathogenicity.
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문제 정의
그리고 분리주들의 혈청형, 병원성 유전자의 파악 및 Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) pattern을 분석하고 각 요소들 간의 연관성을 파악하고자 하였다. 그럼으로써 현재 서울시에 상존하고 있는 레지오넬라균의 유전적 상관관계 및 병원성에 대한 역학 자료 마련을 그 목적으로 한다.
본 연구는 2008년 6월부터 8월까지 서울시 25개구 소재 대형 찜질방을 비롯한 목욕시설과 병원의 욕탕수 및 샤워수, 대형건물의 냉각탑수로부터 레지오넬라균을 검출하였다. 그리고 분리주들의 혈청형, 병원성 유전자의 파악 및 Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) pattern을 분석하고 각 요소들 간의 연관성을 파악하고자 하였다. 그럼으로써 현재 서울시에 상존하고 있는 레지오넬라균의 유전적 상관관계 및 병원성에 대한 역학 자료 마련을 그 목적으로 한다.
제안 방법
2는 plug를 SfⅡ을 사용하여 처리한 PFGE 결과를 clustering한 것이다. 65% 이상의 상동성을 기준으로 하여 A~J까지 10개의 유형으로 pulsotype을 나누었고, 이를 다시 82% 이상의 상동성을 기준으로 A는 A1~A2, B는 B1~B2, C는 C1~C4, D는 D1~D2, E는 E1~E2, F는 F1~F2, G는 G1~G5, H는 H1~H2, J는 J1~J3의 subtype으로 각각 분류하였다. Legionella pneumophila 중 가장 많은 유형은 C pulsotype으로 69주 중 32주로 46.
EtBr (0.5 µg/ml) 용액에서 gel을 30분간 염색한 후, 증류수로 탈색과정을 거친 다음 transilluminator를 이용하여 밴드를 확인하였다.
Legionella pneumophila에 대한 serotype은 serotyping kit(Denka Seiken, Japan)을 사용하여 동정하였다. 생리식염수에 분리균을 진하게 푼 다음 100℃에서 1시간 또는 120℃에서 15분간 가열처리한 후, 슬라이드 응집 시험법에 의한 항혈청-항원액 반응으로 1분 이내에 강한 응집을 보이는 혈청을 혈청형으로 하였다(6, 16).
반응조건은 95℃에서 5분간 initial denaturation한 후, 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분간의 cycle을 30회 반복한 후 최종 72℃에서 5분간 증폭시켰다. 같은 분리균주들에 대하여 icmTSRQ, icmJB, icmWX, icmLK, dotDCB primer (17)(Table 1)를 이용하여 각각의 유전자가 존재하는지 확인하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 initial denaturation한 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초간의 cycle을 30회 반복한 후 최종 72℃에서 5분간 증폭시켰다.
본 연구에서 분리된 Legionella pneumophila 중에서 icmTSRQ, icmJB, icmWX, icmLK, dotDCB가 모두 검출된 균주는 20주였고, 이 중 네 가지만 검출된 균주는 39주, 세 가지만 검출된 균주는 10주였고 그 이하로 검출된 균주는 없었다. 검출된 5가지 병원성 유전자의 조합에 의하여 I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, V, N형으로 정리하였다. I형은 icmTSRQ-icmJB-icmWX-icmLK-dotDCB, Ⅱ은 icmTSRQ-icmJBicmWX-icmLK-ND, Ⅲ형은 icmTSRQ-icmJB-ND-icmLK-dotDCB, Ⅳ형은 ND-icmJB-ND-icmLK-dotDCB, 그리고 기타 V형은 한 개 내지 두 개의 유전자를 가지고 있는 균주이고, 한 가지도 가지지 못한 균주는 N형으로 표시하였다(Fig.
Legionella spp. 균주의 경우에는 보유하고 있는 항혈청으로 동정이 되지 않아 염기서열 분석방법을 이용하였다. 그 결과 4주 모두 Legionella nautarum으로 동정되었다.
Legionella pneumophila에 대한 serotype은 serotyping kit(Denka Seiken, Japan)을 사용하여 동정하였다. 생리식염수에 분리균을 진하게 푼 다음 100℃에서 1시간 또는 120℃에서 15분간 가열처리한 후, 슬라이드 응집 시험법에 의한 항혈청-항원액 반응으로 1분 이내에 강한 응집을 보이는 혈청을 혈청형으로 하였다(6, 16).
반응조건은 95℃에서 5분간 initial denaturation한 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초간의 cycle을 30회 반복한 후 최종 72℃에서 5분간 증폭시켰다. 이 PCR 산물을 1.5% agarose gel을 이용하여 전기영동한 후 유전자의 유무를 확인하였다.
이 후 해부현미경 상에서 cut-glass의 형태를 띄는 집락에 대해 BCYE-α, L-cystein 결핍 BCYE-α, 혈액한천배지에 계대 배양하여 BCYE-α에서는 생장하지만, 후술 2가지의 배지에서는 생장하지 않는 그람음성간균을 레지오넬라균으로 동정하였다(16).
대상 데이터
2008년 6월부터 8월까지 서울시 25개구 소재 대형 찜질방, 목욕탕, 사우나 등 목욕시설의 탕내온수, 샤워온수 및 병원시설의 샤워수, 수도꼭지수, 대형건물의 냉각탑수를 대상으로 총 708건에 대하여 일제히 레지오넬라균 검출 실험을 실시하였다. 대상 시료 1L를 여과한 다음 그 여과지를 잘게 분쇄하여 멸균증류수 20 ml에 넣어서 강하게 와류한 다음, 50℃에서 30분간 열처리한 후 이것을 검액으로 하였다.
본 연구는 2008년 6월부터 8월까지 서울시 25개구 소재 대형 찜질방을 비롯한 목욕시설과 병원의 욕탕수 및 샤워수, 대형건물의 냉각탑수로부터 레지오넬라균을 검출하였다. 그리고 분리주들의 혈청형, 병원성 유전자의 파악 및 Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) pattern을 분석하고 각 요소들 간의 연관성을 파악하고자 하였다.
데이터처리
5 µg/ml) 용액에서 gel을 30분간 염색한 후, 증류수로 탈색과정을 거친 다음 transilluminator를 이용하여 밴드를 확인하였다. PFGE 결과는 BioNumerics software version 3.5 (Applied Maths, Belgium) 를 이용하여 dendrogram을 작성하여 분석하였다.
성능/효과
Lee 등(11)의 결과와 마찬가지로 서울지역에서 분리되는 레지오넬라균의 유전형이 다양함을 나타내고 있다. C pulsotype을 분석해 보면(Table 3 and Fig. 2), 32주 중 29주가 serogroup 1으로서 높은 상관관계를 나타내고 있으나, serogroup 6의 C1, serogroup 3의 C2는 다른 C 균주들과 상동성 66.3%로서 연관성이 다소 떨어졌다. C3의 28주는 상동성이 89.
65% 이상의 상동성을 기준으로 하여 A~J까지 10개의 유형으로 pulsotype을 나누었고, 이를 다시 82% 이상의 상동성을 기준으로 A는 A1~A2, B는 B1~B2, C는 C1~C4, D는 D1~D2, E는 E1~E2, F는 F1~F2, G는 G1~G5, H는 H1~H2, J는 J1~J3의 subtype으로 각각 분류하였다. Legionella pneumophila 중 가장 많은 유형은 C pulsotype으로 69주 중 32주로 46.4%였으며, 그 외 G pulsotype 17.4%, E pulsotype 13.0%, F pulsotype 5.8%, A, B, H pulsotype 4.3%, D, I pulsotype 각각 2.9%, 1.4%로 다양한 유전적 양상을 보였다. Lee 등(11)의 결과와 마찬가지로 서울지역에서 분리되는 레지오넬라균의 유전형이 다양함을 나타내고 있다.
Seung 등(16)의 결과와 비교해 볼 때 전년도에 검출되지 않았던 Legionella spp.가 4주 검출되었으며, Legionella pneumophila의 혈청형의 분포는 전년도에 비해 시료 채취지역의 확대에도 불구하고 검출빈도의 순서는 달라진 바가 없고, 4형은 여전히 검출되지 않았다. 6형의 경우 절반정도의 검출률에 그쳤는데 이는 2007년에 6형이 대다수 검출된 서대문구에서의 시료건수 및 검출건수가 전체대비 감소한 영향으로 보여진다.
1과 Table 3을 보면 A pulsotype에 속하는 균은 serogroup은 다르지만 모두 Ⅲ형의 pathogenic pattern을 가지고 있고, B는 모두 Ⅱ형, D는 I형, E는 9주 모두가 Ⅳ형으로 이루어져 있으며, F는 Ⅲ형, G는 12주 모두가 I형으로 이루어져 있다. 가장 많은 균주를 가지는 C형은 32주 중 27주가 Ⅱ형의 pathogenic pattern을 보였고 본 실험에서 분리된 Legionella nautarum은 V형 또는 N형으로 파악되었다. 이 결과는 PFGE pattern과 pathogenic gene pattern이 유의한 관계에 있음을 보여주고 있으며, PFGE pattern 분석에 의한 병원성의 예측을 가능하게 한다.
균주의 경우에는 보유하고 있는 항혈청으로 동정이 되지 않아 염기서열 분석방법을 이용하였다. 그 결과 4주 모두 Legionella nautarum으로 동정되었다.
단 한 주가 분리되었던 serogroup 2의 pathogenic gene pattern은 Ⅳ로서, Legionella pneumophila serogroup 2의 증식 및 분리율이 떨어지는것에 대한 한 가지 이유로서 유전적인 결손을 추측할 수 있겠다. 더불어 본 연구에서 분리되었던 3주의 Legionella nautarum은 V형이거나 N형으로서 병원성이 많이 떨어짐을 추정할 수 있다.
4%로 나타났다. 본 연구에서 분리된 Legionella nautarum의 양상과는 달리 Legionella pneumophila에서는 3개 이상의 유전자를 가진 균주가 100%였다. 단 한 주가 분리되었던 serogroup 2의 pathogenic gene pattern은 Ⅳ로서, Legionella pneumophila serogroup 2의 증식 및 분리율이 떨어지는것에 대한 한 가지 이유로서 유전적인 결손을 추측할 수 있겠다.
그러므로 icm/dot 유전자는 레지오넬라균으로 하여금 숙주세포로의 접근부터 최종적으로 숙주세포로부터의 탈출까지 모든 과정에 영향을 끼치는 요소라 할 수 있다. 본 연구에서 분리된 Legionella pneumophila 중에서 icmTSRQ, icmJB, icmWX, icmLK, dotDCB가 모두 검출된 균주는 20주였고, 이 중 네 가지만 검출된 균주는 39주, 세 가지만 검출된 균주는 10주였고 그 이하로 검출된 균주는 없었다. 검출된 5가지 병원성 유전자의 조합에 의하여 I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, V, N형으로 정리하였다.
Seung 등(16)의 결과와 비교해 봤을 때, 그 외의 pulsotype은 serogroup에 따른 특이점이나 공통점을 보이지 않는 결과를 알 수 있으며 이는 레지오넬라균이 같은 serogroup이라 할지라도 유전형이 다양하게 분화되어감을 보여주고 있다. 본 연구에서 유일하게 출현한 serogroup 2는 유전적 유연관계가 다른 Legionella pneumophila에 대해 상동성이 40%이하로 떨어짐으로써 독립적인 유전형을 형성하고 있다. 또한 4주의 Legionella nautarum은 예상했던 대로 Legionella pneumophila에 대해 낮은 상동성(37.
연장선상에서 본 실험의 I~V형, N형의 pathogenic gene pattern에 의미를 부여하자면, Ⅰ>Ⅱ=Ⅲ> Ⅳ > V > N의 순으로 병원성을 가진다 할 수 있다. 본 연구의 레지오넬라균의 pathogenic gene pattern은 Ⅱ형이 가장 많은 30주로 41.1%를 차지했고, I형이 20주 27.4%, Ⅳ형 10주 13.7%, Ⅲ형 8주 11%, N형 3주 4.1%, V형 1주 1.4%로 나타났다. 본 연구에서 분리된 Legionella nautarum의 양상과는 달리 Legionella pneumophila에서는 3개 이상의 유전자를 가진 균주가 100%였다.
가장 많은 균주를 가지는 C형은 32주 중 27주가 Ⅱ형의 pathogenic pattern을 보였고 본 실험에서 분리된 Legionella nautarum은 V형 또는 N형으로 파악되었다. 이 결과는 PFGE pattern과 pathogenic gene pattern이 유의한 관계에 있음을 보여주고 있으며, PFGE pattern 분석에 의한 병원성의 예측을 가능하게 한다. Icm/Dot 유전자는 레지오넬라균으로 하여금 병원성을 갖게 하는 대표적인 유전자로서, 레지오넬라균이 인체를 숙주로 하여 생존할 수 있게끔 하는 필수적인 요소이다(3, 18, 19 etc).
후속연구
레지오넬라균에 대한 노출이 증가하고 있는 상황에서 레지오넬라균에 의한 위험의 예측은 공중보건상 중요하다. 앞으로 환경 뿐만 아니라 사람에서 분리한 레지오넬라균을 함께 연구, 분석하고, 더불어 genetic pathogenicity 뿐만 아니라 intracellular pathogenicity 연구를 병행함으로써 레지오넬라균에 대한 학문적 이해도를 더욱 심화할 수 있으며, 현실적으로 감염원과 감염경로의 파악 및 대책 수립에 유용한 자료를 제공할 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
레지오넬라증은 무엇에 의해 발병하는가?
레지오넬라증(Legionellosis)은 레지오넬라 폐렴(폐렴형)과 열성 질환인 폰티악열(비폐렴형)의 2가지 임상증상을 가지는 호흡기질환으로 레지오넬라균의 감염에 의해 발병한다(7). 특히 어린이나노약자, 환자와 같이 면역력이 떨어진 개체에 대해서 치명적인 폐렴을 유발한다.
레지오넬라균은 무엇인가?
레지오넬라균은 치명적인 폐렴을 일으킬 수 있는 균으로서, 기후 온난화와 함께 노출의 수위가 높아지고 있는 병원성균이다. 본 연구는 2008년 6월부터 8월까지 서울시내 25개구 소재 수계시설에서 분리한 레지오넬라균 73개 주에 대해 혈청형, Dot/Icm라 일컬어지는 병원성 유전자 분석 그리고 Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)를 실시하여 유전자형과 그들 사이의 상관관계를 파악하였다.
레지오넬라증은 특히 어떤 개체에 치명적인 폐렴을 유발하는가?
레지오넬라증(Legionellosis)은 레지오넬라 폐렴(폐렴형)과 열성 질환인 폰티악열(비폐렴형)의 2가지 임상증상을 가지는 호흡기질환으로 레지오넬라균의 감염에 의해 발병한다(7). 특히 어린이나노약자, 환자와 같이 면역력이 떨어진 개체에 대해서 치명적인 폐렴을 유발한다. 레지오넬라균은 자연계의 토양과 수환경(하천, 호수, 강 등) 내에 범(凡)환경적으로 존재하며 환경 속에서 자연적인 변동을 지속한다(8).
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