[논문]Real-time PCR을 이용한 환경 중 물 시료의 레지오넬라 분석법 연구

이정희; 박명기; 김윤성; 윤희정; 이창희; 정아용; 윤미혜

doi:10.5668/jehs.2019.45.5.511

Real-time PCR을 이용한 환경 중 물 시료의 레지오넬라 분석법 연구
Study on the Enumeration of Legionella in Environmental Water Samples Using Real-time PCR 원문보기

韓國環境保健學會誌 = Journal of environmental health sciences, v.45 no.5, 2019년, pp.511 - 519

이정희 (경기도보건환경연구원 면역진단팀) , 박명기 (경기도보건환경연구원 면역진단팀) , 김윤성 (경기도보건환경연구원 면역진단팀) , 윤희정 (경기도보건환경연구원 면역진단팀) , 이창희 (경기도보건환경연구원 면역진단팀) , 정아용 (경기도보건환경연구원 면역진단팀) , 윤미혜 (경기도보건환경연구원 면역진단팀)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: The standard method for the enumeration of environmental Legionella is culturing, which has several disadvantages, including long incubation and poor sensitivity. The purpose of this study is to demonstrate the usefulness of real-time PCR and to improve the standard method. Methods: In 200 environmental water samples, a real-time PCR and culture were conducted to detect and quantify Legionella. Using with the results of the survey, we compared the real-time PCR with the culture. Results: Each real-time PCR assay had 100% specificity and excellent sensitivity (5 GU/reaction). In the culture, 36 samples were positive and 164 samples were negative. Based on the results of the culture, real-time PCR showed a high negative predictive value of 99%, 35 samples were true positive, 105 samples were true negative, 59 samples were false positive and one sample was a false negative. Quantitative analysis of the two methods indicated a weak linear correlation ($r^2=0.29$, $r^2=0.61$, respectively). Conclusions: Although it is difficult to directly apply quantitative analysis results of real-time PCR in the enumeration of environmental Legionella, it can be used as a complementary means of culturing to rapidly screen negative samples and to improve the accuracy of diagnosis.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. List of Legionella and non-Legionella strains used for specificity tests
표 Table 1. Continued
그림 Fig. 1. Standard curves for quantification of real-time PCR assays.
그림 Fig. 2. Correlation of Legionella culture and real-time PCR results (16S rRNA) for 30 of 200 water samples.
그림 Fig. 3. Correlation of Legionella culture and real-time PCR results (mip) for 24 of 200 water samples.
표 Table 2. Comparison of the detection Legionella spp. and the detection Legionella pneumophila using real-time PCR relative to culture; culture and real-time PCR positive value>LOD (limit of detection)
표 Table 3. Ability of real-time PCR to positive predict value and negative predict value relative to culture

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

¹²⁾ 이러한 장점에도 불구하고 realtime PCR (Genome Unit, GU)에 의해 얻어진 결과와 배양법(Colony Forming Unit, CFU)에 의해 얻어진 결과에 큰 차이가 있어서 실제로 일상적인 검사에 적용했을 때 혼선을 일으킬 수 있다. 따라서 환경 중 물 시료의 레지오넬라균에 대한 배양법과 real-time PCR을 비교 및 분석하여 real-time PCR의 유용성을 평가하고 적용방안을 모색하였다.

제안 방법

따라서 본 연구는 국내 제조 시약 중 민감도가 낮고 저렴하며 사용법이 매우 간단한 boiling법을 적용한 DNA extract kit와 일반적으로 배양한 집락에서 레지오넬라균을 검출할 때 많이 사용하는 국내 K사의 레지오넬라 검출용 multiplex real-time PCR kit를 선정하여 환경 중 물 시료 200개를 농축 후 검사에 적용하였다. 그리고 같은 농축액으로 질병관리본부 지침에 따라 배양법을 시행한 후 그 결과를 서로 비교하였다.
또한 해외에서 개발된 real-time PCR 진단 키트는 가격이 너무 비싸며 적용 가능한 real-time PCR 장비도 한계가 있어 장비를 교체해야 하므로 국내 현실과는 맞지 않는다. 따라서 본 연구는 국내 제조 시약 중 민감도가 낮고 저렴하며 사용법이 매우 간단한 boiling법을 적용한 DNA extract kit와 일반적으로 배양한 집락에서 레지오넬라균을 검출할 때 많이 사용하는 국내 K사의 레지오넬라 검출용 multiplex real-time PCR kit를 선정하여 환경 중 물 시료 200개를 농축 후 검사에 적용하였다. 그리고 같은 농축액으로 질병관리본부 지침에 따라 배양법을 시행한 후 그 결과를 서로 비교하였다.

대상 데이터

레지오넬라균 검사를 목적으로 2018년 2~9월 사이에 의뢰된 냉각탑수, 온수, 냉수, 수돗물, 저수조 등 물 시료 200개를 수집하였다. 이 시료 1L를 0.
특이도를 분석하기 위하여 Table 1과 같이 레지오넬라 표준균주 5종, 경기도내 환경 시료에서 분리된 레지오넬라균 15종 및 non-Legionella 표준균주 47종을 이용하였다. 모든 균주는 GVPC 배지에서 배양 후 DNA를 PowerPrep^TM Quick DNA Extract kit로 추출하여 시험하였다.

데이터처리

Real-time PCR의 데이터는 AppliedBiosystems Real-Time PCR System Sequence Detection Software version.1.4를 사용하여 분석하였다. 배양법과 real-time PCR의 결과비교 및 상관관계(Correlation) 계산은 Microsoft Excel을 사용하였다.

이론/모형

이에 본 연구에서는 ISO/TS 12869:2012와 ISO/ TS 12869:2019를 참조하여 국내 환경에 적합한 real-time PCR을 수립하고 시행하였다. 그 결과 99%의 높은 음성예측도를 보여 4시간 안에 52.

성능/효과

Real-time PCR과 배양법의 정량분석은 상관관계가 낮아 직접적인 비교는 어려웠다. 이것은 real-time PCR이 감염력이 있는 세균과 죽은 세균을 구분 못하기 때문인데 이로 인해 위양성이 많아진다.
이에 본 연구에서는 ISO/TS 12869:2012와 ISO/ TS 12869:2019를 참조하여 국내 환경에 적합한 real-time PCR을 수립하고 시행하였다. 그 결과 99%의 높은 음성예측도를 보여 4시간 안에 52.5%의 음성을 선별하고 신속하게 양성을 확인할 수 있었다. 이것은 시간과 노동력을 절약하는 효과가 있고 검사 대상 수계시설의 빠른 재가동이 가능해 잠재적으로 경제적인 효과가 있다.
이것은 real-time PCR이 감염력이 있는 세균과 죽은 세균을 구분 못하기 때문인데 이로 인해 위양성이 많아진다. 그러나 지속적으로 관리를 하지 않고 검사 직전에 소독약을 급하게 투여 했을 경우나 레지오넬라균이 존재하나 배양이 불가능한 경우에 real-time PCR을 이용하면 오히려 레지오넬라균의 검출이 가능해 이를 활용하면 검사의 정확도를 높일 수 있다.
따라서 환경 시료의 레지오넬라균 검사에 기존의 배양법을 표준분석법으로 하고 이에 대한 보완방법으로써 real-time PCR의 병행사용을 제안한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	레지오넬라증은 무엇인가?	발생 양상을 월별로 분석하면 연중 발생하지만 6~8월에 상대적으로 많이 발생하고 있다. 이 질환은 레지오넬라 폐렴(Legionnaires’ disease)과 독감형인 폰티악열(Pontiac fever)의 두 가지 유형이 있으며 레지오넬라 폐렴은 심각한 감염증을 나타내고 폰티악열의 경우 경미한 증상을 나타낸다. 레지오넬라 폐렴의 주요 증상은 두통, 근육통, 허약감, 고열, 오한 등 비특이적 증상이 나타나며 마른기침, 복통, 설사 등이 동반된다.
	레지오넬라 폐렴의 주요 증상은 무엇인가?	이 질환은 레지오넬라 폐렴(Legionnaires’ disease)과 독감형인 폰티악열(Pontiac fever)의 두 가지 유형이 있으며 레지오넬라 폐렴은 심각한 감염증을 나타내고 폰티악열의 경우 경미한 증상을 나타낸다. 레지오넬라 폐렴의 주요 증상은 두통, 근육통, 허약감, 고열, 오한 등 비특이적 증상이 나타나며 마른기침, 복통, 설사 등이 동반된다. 폰티악열은 짧은 잠복기의 급성 발열성 질환으로 특별한 치료 없이 2~5일 내 회복이 된다.
	레지오넬라 폐렴의 원인균은 무엇이고 종류는 얼마나 되는가?	원인균인 레지오넬라균은 그람음성 호기성 단간균으로 지금까지 50여종이 알려져 있으며, 20여 종의 레지오넬라균이 사람에게 감염을 일으키는 것으로 보고되었다.6) 그중 레지오넬라증의 80~90%는 L. pneumophila가 원인균인 것으로 알려져 있다.7) 주요 감염경로는 냉각탑, 건물의 수계시설,8) 온천9) 등에 존재하던 균이 에어로졸 형태로 인체에 흡입되면서 전파되며, 일반적으로 사람 간 전파는 없다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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