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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 S. coelicolor A3(2)의 유전정보를 바탕으로 β-glucosidase 유전자를 분리하고, 그 특성을 조사하여 물질전환을 위한 응용분야에 활용하고자 한다.
제안 방법
- β-Glucosidase의 활성은 ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(ρNPG)를 기질로 이용하여 측정하였다[20].
- S. coelicolor A(3)2 균주의 유전자 DNA를 추출한 뒤 sense primer : ATGAGTGAGTACCCCGGTTTCCCG, antisense primer : TCACCCGCGGTTGGCGGCGATCATC를 이용하여 PCR반응(95℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃1분 30초 동안 35회 증폭)을 하였다. 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector(Promega, USA)에 삽입하여 염기서열을 확인한 후, 발현 벡터인 pET15b(Invitrogen, USA)에 ligation하고, 재조합 단백질 발현용 host인 E.
- Streptomyces coelicolor A(3)2 균주에서 분리한 유전자 DNA를 이용하여 PCR하여 1.5 kb의 PCR 산물을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 조사하고, NCBI의 BLAST search를 하여 S.
- Streptomyces coelicolor A3(2)의 β-glucosidase 유전자를 분리하여 대장균에서 발현하여 특성을 조사하였다.
- 이러한 β-glucosidase는 1377염기서열의 51 kDa 분자량의 단백질로 분리하기 위해서 상등액을 여과하고 Histrap column을 이용하여 정제하였다. pNPG 활성분획은 12% SDS-PAGE를 통해 확인 하였으며 투석을 통해 imidazole을 제거하였다(Fig. 2).
- 기질에 대한 β-glucosidase의 pH 및 온도에 따른 특성을 조사하였다.
- 기질에 대한 효소의 최적반응온도와 pH를 측정하였으며 기질로는 α-pNPG, β-pNPF, pNPG, βpNPGA를 사용하였다.
- β-Glucosidase의 1 unit는 ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside에서 ρ-nitrophenol(ρNP) 1 µmol을 1분 동안 생산 하는데 필요한 양으로 정의하였다. 기질에 사용된 flavonoids는 HPLC(Varian, USA)를 이용하여 분석하였으며, Varian C18 역상 column을 이용하여 유속 1 mL/min으로, 이동상 A: 0.1% formic acid, B: acetonitrile로 245 nm에서 65분간 분석하였다.
- 5). 다른 화학구조를 가지는 기질과의 활성을 조사하기 위하여 당이 결합된 flavonoids를 이용한 기질특이성을 조사하였으며 daidzin, genistin, glycitin, esculin, apigenin-7-glucose 등을 사용하였다. β-pNPGA에 대한 상대활성은 daidzin 17%, glycitin 12%, genistin 8% 순으로 나타났으며 esculin과 apigenin-7-glucose 두 기질은 활성을 나타내지 않았다(Table 1).
- 발현을 위한 E. coli BL21(DE3) pLys 형질전환균을 10 mL LB 배지에 종균접종 후, 종균 배양액을 1 L LB배지(Difco Lab., USA)에 접종하여 abs 600 nm에서 O.D. 값이 0.8 이상일 때 최종농도 0.1 mM가 되도록 IPTG를 첨가하여 16시간 동안 배양하였다. 배양액은 5000 rpm에서 30분간 원심분리 한 뒤 균체를 20 mM Tris-HCl(pH 8.
- 부분정제된 β-glucosidase(ScBGL1)의 활성은 β-glucosidase assay 법으로 조사하였으며 반응buffer의 조건에 따라 활성이 다르게 나타났으며, 기질로 pNPG를 이용하였다.
- 용출된 재조합 β-glucosidase는 12% SDS-PAGE를 이용하여 확인하였으며[18], imidazole은 투석하여 제거하였다.
- 정제된 β-glucosidase를 β-glucosidase assay 법을 통해 측정하였으며 시간과 온도, pH를 단계적으로 조사하였다.
- coelicolor A(3)2 균주의 유전자 DNA를 추출한 뒤 sense primer : ATGAGTGAGTACCCCGGTTTCCCG, antisense primer : TCACCCGCGGTTGGCGGCGATCATC를 이용하여 PCR반응(95℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃1분 30초 동안 35회 증폭)을 하였다. 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector(Promega, USA)에 삽입하여 염기서열을 확인한 후, 발현 벡터인 pET15b(Invitrogen, USA)에 ligation하고, 재조합 단백질 발현용 host인 E. coli BL21(DE3) pLys(Novagen, Inc.)로 형질전환 시켰다.
- 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 조사하고, NCBI의 BLAST search를 하여 S. coelicolor A(3)2의 β-glucosidase 유전자의 염기서열임을 확인하고, 발현벡터 pET15b에 cloning하였다.
- 기질에 대한 효소의 최적반응온도와 pH를 측정하였으며 기질로는 α-pNPG, β-pNPF, pNPG, βpNPGA를 사용하였다. 한편, 금속이온 등에 대한 효소활성을 측정하였으며, 반응액에 10 mM이 되도록 MnSO4, MgSO4, CuSO4, ZnSO4, CaSO4, NaSO4, KCl, EDTA, SDS, DTT 및 mercaptoethanol을 첨가한 뒤 실온에서 15분간 반응시켰다.
- 형질전환 된 E. coli BL21(DE3) pLys를 LB 배지에 접종하여 발현시켰다. 적정 IPTG 농도를 조사하기 위하여 0, 0.
- 효소활성 최적반응시간은 10-30분까지 10분 간격으로 측정하였으며, 최적반응온도는 buffer를 pH 5, 6으로 구분하여 20-70℃까지 10℃ 간격으로 측정하였고, 최적활성 pH는 pH 3-10까지 pH 1 간격으로 측정하였다. 사용한 buffer는 pH 범위에 따라서 pH 3.
대상 데이터
- coelicolor A(3)2의 β-glucosidase 유전자의 염기서열임을 확인하고, 발현벡터 pET15b에 cloning하였다. 발현벡터에 삽입이 확인된 plasmid pET15bScBGL는 E. coli BL21(DE3) pLys에 형질전환시켜 재조합 단백질 발현에 사용하였다.
- 본 연구에서 사용한 Streptomyces coelicolor A(3)2 균주는 한국표준균주은행에서 분양받아 사용하였고, 배양을 위하여 nutrient broth (Difco. USA)에서 7일간 28℃에서 배양하였다. 활성측정에 사용된 기질은 ρ-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(α-pNPG), ρ-nitrophenyl-β-D-fucopyranoside(β-pNPF), ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG), ρ-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(β-pNPGA), Daidzin, Genistin, Glycitin, Esculin, Apigenin-7-glucose은 Sigma사(USA)로부터 구입하여 사용하였고, 금속이온 및 환원제로 사용된 MnSO4, MgSO4, CuSO4, ZnSO4, CaSO4, NaSO4, KCl, EDTA, SDS, DTT, mercaptoethanol 또한 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.
- 활성측정에 사용된 기질은 ρ-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(α-pNPG), ρ-nitrophenyl-β-D-fucopyranoside(β-pNPF), ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG), ρ-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(β-pNPGA), Daidzin, Genistin, Glycitin, Esculin, Apigenin-7-glucose은 Sigma사(USA)로부터 구입하여 사용하였고, 금속이온 및 환원제로 사용된 MnSO4, MgSO4, CuSO4, ZnSO4, CaSO4, NaSO4, KCl, EDTA, SDS, DTT, mercaptoethanol 또한 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- 농축된 단백질의 정량은 Bradford method를 이용하여 흡광도 595 nm에서 측정하였으며[3], bovine serum albumin(BSA)를 표준단백질로 사용하였다.
성능/효과
- α-pNPG, β-pNPG, β-pNPF에 대한 온도에 따른 활성변화는 20-70℃까지 큰 변화폭을 보이지 않고 있으며, 60℃에서 β-pNPF의 활성이 다소 높게 나타난 반면, β-pNPGA는 30-50℃까지 활성이 증가하여 50℃에서 가장 높은 활성을 보였다(Fig. 5).
- β-Glucosidase 활성은 EDTA, DTT에 의해 억제되었으며, MnSO4, CaCl2, KCl, MgSO4에 의해 증가하였고, 특히 Mn이온에 의해 증가하였다.
- β-Glucosidase 활성은 EDTA와 DTT에서는 억제되었으며, SDS와 mercaptoethanol에서는 대조구와 비슷하였다(Fig. 6).
- β-pNPGA는 다른 기질보다 pH 5-9까지 높은 활성을 나타냈으며, 특히 pH 9에서는 약 3배 이상 높은 활성을 나타냈다(Fig. 4).
- β-pNPGA에 대한 상대활성은 daidzin 17%, glycitin 12%, genistin 8% 순으로 나타났으며 esculin과 apigenin-7-glucose 두 기질은 활성을 나타내지 않았다(Table 1).
- 6). 1가 및 2가 금속이온으로 MnSO4, CaCl2, KCl, MgSO4에서는 효소활성이 증가하였으며, 특히 Mn 이온이 효소의 활성을 약 3.5배 증가시키는 것으로 나타났다. CuSO4, NaCl은 효소활성을 저해하였으며 특히, ZnSO4는 β-glucosidase 에 대하여 높은 저해활성을 나타냈다(Fig.
- β-Glucosidase 활성은 EDTA, DTT에 의해 억제되었으며, MnSO4, CaCl2, KCl, MgSO4에 의해 증가하였고, 특히 Mn이온에 의해 증가하였다. CuSO4, NaCl에 의해 효소활성이 저해되었으며, 특히 ZnSO4의 경우 효소활성이 강하게 억제되었다.
- 3). pH 변화에 따른 활성은 pH 3과 pH 9 이상에서는 낮은 활성을 나타냈으며, pH 7에서 가장 높은 활성을 나타냈다(Fig. 3).
- 최적 활성을 나타내는 온도는 pH 5에서는 20℃, pH 6에서는 60℃에서 높은 활성을 나타냈다. pH에 따른 활성은 pH 3 이하와 pH 9 이상의 범위에서는 낮은 활성을 나타냈으며 pH 7에서 가장 높은 활성을 나타냈다.
- 기질 α-pNPG, β-pNPG, β-pNPF의 온도에 따른 활성변화는 β-pNPF의 활성이 60℃에서 증가하였고, β-pNPGA는 30-50℃까지 활성이 증가하여 50℃에서 최대활성을 나타내었다.
- coli BL21(DE3) pLys를 LB 배지에 접종하여 발현시켰다. 적정 IPTG 농도를 조사하기 위하여 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1 mM 농도로 배지에 첨가하여, 0.1 mM IPTG 농도에서 가장 높게 발현되는 것을 확인하였고, 25℃에서 가장 높게 발현되었다(Fig. 1). 이러한 β-glucosidase는 1377염기서열의 51 kDa 분자량의 단백질로 분리하기 위해서 상등액을 여과하고 Histrap column을 이용하여 정제하였다.
- 부분정제된 β-glucosidase(ScBGL1)의 활성은 β-glucosidase assay 법으로 조사하였으며 반응buffer의 조건에 따라 활성이 다르게 나타났으며, 기질로 pNPG를 이용하였다. 최적 반응시간은 10-30분까지 10분 간격으로 측정한 결과 30분 이후에는 활성의 변화가 크게 나타나지 않았고 안정성이 유지되었으며 15분 동안 반응시킬 때 최적활성을 나타냈다. 온도에 따른 활성은 pH 5일 때 20℃, pH 6 일 때 60℃에서 가장 높은 활성을 나타냈다.
- Streptomyces coelicolor A3(2)의 β-glucosidase 유전자를 분리하여 대장균에서 발현하여 특성을 조사하였다. 최적 활성을 나타내는 온도는 pH 5에서는 20℃, pH 6에서는 60℃에서 높은 활성을 나타냈다. pH에 따른 활성은 pH 3 이하와 pH 9 이상의 범위에서는 낮은 활성을 나타냈으며 pH 7에서 가장 높은 활성을 나타냈다.
후속연구
- ScBGL1의 경우 cellobiose와 CMC에서 활성을 나타내지 않고 있어 1 group에 속한다고 보이나, β-glucosidase의 기질선택 폭이 넓은 점을 생각 한다면 보다 다양한 기질선택의 조사가 필요하다고 본다.
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