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문제 정의
- coelicolor A3(2)에서의 esterase 발현은 과산화수소 저항성 인자와 관련되어 있음이 확인되었고, 이는 esterase가 기존에 알려진 고유 기능 이외에 산화적 스트레스에 대한 방어적 기능으로서의 새로운 기능을 가지고 있음을 시사한다고 사료된다(28). 따라서 이번 실험에서는, 방선균의 acetyl xylan esterase와 산화적 스트레스에 관한 관련성을 연구하는 첫 단계로 S. coelicolor A3(2)의 acetyl xylan esterase 유전자를 클로닝 하여 대장균에서 발현시켰고 그 발현 양상을 관찰하였다.
- c湖에 형질전환시킨 결과 12개의 흰색 colony를 얻을 수 있었다. 이렇게 얻어진 흰색 colony들이 徴函를 가지고 있는지를 확인하였다. 우선 흰색 colony로부터 plasmid를 분리하였고, 제한효소의 처리를 통하여 plasmid의 크기를 비교하였다.
제안 방법
- 배양액을 13, 000Xg에서 1분간 원심분리하여 균체를 회수하고 alkaline 용해와 sodium acetate 침전을 통하여 재조합 plasmid를 추출하였다(20). 이 재조합 plasnHd에 <"函가 삽입되었는지를 알아보기 위해 EcoR I (Promega, USA)으로 절단하였다. 제한효소의 반응은 제조회사의 지시에 따라 수행하였으며 agarose gel에 전기영동하여 그 결과를 관찰하였다.
- coelicolor A3(2)의 genomic DNA 분리에 사용된 균체를 얻기 위하여 한천이 생략되고 34% sucrose를 첨가한 YEME 배양액에 새로 생산된 포자를 충분히 접종하였다. 30, C에서 2일간배양한 후, 원심분리기(13, 000Xg)를 사용하여 균체를 수확하였다.
- 34% sucrose가 함유된 YEME배지에서 2일간 배양된 S. coelicolor A3(2)에서 genomic DNA를 주출하였다. 주줄한 DNA 를 0.
- axeAUP와 pETBlueDOWN primer, 破。ADOWN와 pETBlue DOWN primer, itxeAUP와 pETBlueUP primer, axeADOWN와 pETBlueUP primer, 그리고 心eAUP와(7把ADOWN primer를 PCR을 위한 primer set으로 설정하여 PCR을 시행하였다. PCR 조건 및 thermal cyclere 위와 동일한 방법으로 시행하였다.
- Nested PCR를 통하여(2把A를 확인하기 위하여, 四函의 start codon쪽의 약 300 base pair를 증폭할 수 있는 primer를 제작하였다.
- PCR 조건 및 thermal cyclere 위와 동일한 방법으로 시행하였다.
- S. coelicolor A3(2)의 genomic DNA 분리에 사용된 균체를 얻기 위하여 한천이 생략되고 34% sucrose를 첨가한 YEME 배양액에 새로 생산된 포자를 충분히 접종하였다. 30, C에서 2일간배양한 후, 원심분리기(13, 000Xg)를 사용하여 균체를 수확하였다.
- 조사하였다. T7 promoter와 axeA의 판독방향이 서로 동일한지, 혹은 반대 방향인지를 확인하기 위하여 4종류의 primer (pETBlueUP, pETBlueDOWN, axeAUP, axeADOWN)를 적절히 조합하여 다양한 primer set를 설정하고 PCR을 시행하였다(Fig. 3). Table 2에서 보는 바와 같이 pETBlueUP primer와 pETBlueDOWN primer, 그리고 axeAVJP primer와(队函DOWN primer를 이용한 PCR 결과를 기준으로 상호 비교하여 or函가 정방향으로 삽입된 colony를 구분할 수 있었다.
- 신선하게 형성된 포자를 백금이로 긁어 모아 증류수에 풀어서 접종액으로 사용하였다. YEME 평판배지는 yeast extract 3 g, malt extract 5 g, 한천 1.7%를 D.W. 1 1.에 녹인 후 고압증기멸균하고 2 ml의 2.5 M의 MgCl2 - 6^0와 20 ml의 50% glucose를 첨가하여 제조하였다
- oxeA가 E. coli 내에서 발현되는지의 여부를 확인하기 위하여 pAXEA#4와 pAXEA#8을 단백질 발현용 균주인 Tuner™(DE3) pLacI E. coli 세포로 형질전환하고 IFTG를 첨가하여 발현양상을 관찰하였다. 그 결과 예상대로 pAXEA#4를 보유하는 균주(#4-1) 에서는 새로운 단백질을 발현하는 것으로 관찰되었다.
- 그러나 PCR 산물의 cloning에 있어서는 그 방향성의 확인이 중요시되므로, 본 실험에서도 흰색 colony로부터 얻어진 재조합 plasmid에 대해서 axeA가 삽입된 방향을 조사하였다. T7 promoter와 axeA의 판독방향이 서로 동일한지, 혹은 반대 방향인지를 확인하기 위하여 4종류의 primer (pETBlueUP, pETBlueDOWN, axeAUP, axeADOWN)를 적절히 조합하여 다양한 primer set를 설정하고 PCR을 시행하였다(Fig.
- 진탕배양(150rpm)하였다. 배양액을 13, 000Xg에서 1분간 원심분리하여 균체를 회수하고 alkaline 용해와 sodium acetate 침전을 통하여 재조합 plasmid를 추출하였다(20). 이 재조합 plasnHd에 <"函가 삽입되었는지를 알아보기 위해 EcoR I (Promega, USA)으로 절단하였다.
- 이렇게 얻어진 흰색 colony들이 徴函를 가지고 있는지를 확인하였다. 우선 흰색 colony로부터 plasmid를 분리하였고, 제한효소의 처리를 통하여 plasmid의 크기를 비교하였다. pETBlue-1 AccepTor Vector에는 하나의 EcoR I에 대한 절단 부위를 가지고 있어서 EcoR I을 이용하여 절단할 경우, PCR 산물이 삽입되어져 있지 않을 경우에는 약 3.
- coelicolor cosmid C-75A)에 대한 정보를 얻었다. 이를 근거로 S. coelicolor A3(2)로부터 axeA 전체를 하나의 PCR 산물로 얻고 동시에 발현시키기 위하여 start codon과 stop codon 이 PCR 산물의 양 말단에 위치하도록 PCR primerS 제작하였다.
- 재조합 plasmid에서 T7 promoter와 s泓의 판독 방향이 일치하여 유전자 발현이 가능한지, 또는 반대 방향으로 들어간 것인지를 확인하기 위하여 oxMUP prime「와 arMDOWN primer, pETBlueUP primer 그리고 pETBlueDOWN primer (Novagen, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 飲函UP과 tuMDOWN primere 위에서 사용한 primer를 사용하였고, pETBlueUP과 pETBlueDOWN primere- pETBlue-1 AccepTor Vector0]] 포함된 부분을 새로 제조하여 사용하였고, 그 염 기서 열은 다음과 같다.
- 이 재조합 plasnHd에 <"函가 삽입되었는지를 알아보기 위해 EcoR I (Promega, USA)으로 절단하였다. 제한효소의 반응은 제조회사의 지시에 따라 수행하였으며 agarose gel에 전기영동하여 그 결과를 관찰하였다.
- coelicolor A3(2)이었다. 포자용액을 yeast extract-malt extract (YEME) 평판배지에 접종하고 3(TC에서 일주일 배양하여 포자가 충분히 생산되도록 하였다. 신선하게 형성된 포자를 백금이로 긁어 모아 증류수에 풀어서 접종액으로 사용하였다.
대상 데이터
- NCBI GeneBank (http://www.ncbi.기m.nih.gov/BLAST/)로부터, S. Hvidam의 tzx函와 이와 상응하는 S. coelicolor A3(2)의 open reading frame (5. coelicolor cosmid C-75A)에 대한 정보를 얻었다. 이를 근거로 S.
- 이용하여 PCR을 수행하였다. 飲函UP과 tuMDOWN primere 위에서 사용한 primer를 사용하였고, pETBlueUP과 pETBlueDOWN primere- pETBlue-1 AccepTor Vector0]] 포함된 부분을 새로 제조하여 사용하였고, 그 염 기서 열은 다음과 같다.
- 이 균주와 재조합 plasmid를 각각 재조합균주#4와 pAXEA#4로 명명하였다. 또한 반대 방향으로 삽입된 균주와 재조합 plasmid는 각각 재조합균주 #8과 pAXEA#8로 명명하였다(Table 2), 12개의 형질전환체 중 7개는 山泓가 T7 promoter의 조절을 받도록 삽입되었고 반대 방향으로 삽입된 균주는 5개로 판명되었다.
- 실험에서 사용된 균주는 -20℃에서 포자상태로 보관되고 있던 S. coelicolor A3(2)이었다. 포자용액을 yeast extract-malt extract (YEME) 평판배지에 접종하고 3(TC에서 일주일 배양하여 포자가 충분히 생산되도록 하였다.
- 클로닝과 발현에 사용된 E. c시E는 NovaBlue™ competent cells과 Tuner™ (DE3)pLacI competent cells (Novagen, USA)을 구입하여사용하였다. E.
- 이때 적용된 방법은 제조 회사가 지시한 방법에 따랐다. 형질전환 균체는 carbenicillin (Sigma, USA) 50tetracycline (Sigma, USA) 15 μg/r이과 X-G저 (Promega, USA) 70 gg/ml, IFTG (Promega, USA) 80 μM이 첨가된 LB agar plate 에 도말 한 후, 37C에서 15~18시간 배양하였고 횐색의 콜로니를 재조합 plasmid를 가지고 있는 균주로 선별하였다.
이론/모형
- 90 vol! 에서 30분, 120 vc山에서 60분 동안 전개시켰다. 또한 표준단백질 marker로는 prestained SDS-PAGE Standards (Bio-Rad, USA)를사용하였다.
- 24~1 mM)로 단백질합성을 유도하였다. 합성된 단백질은 균체 추출액을 Laemn山의방법에 따라 SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동하여 확인하였다(14). 우선 얻어진 균체를 초음파(Sonics, USA)로 파쇄하여 세포 추출액을 준비한 후, 준비된 시료에 2Xsample buffer (100 mM DTT, 2% SDS, 80 mM Tris-HCl (pH 6.
성능/효과
- PCR로 증폭된 axe/l는 pETBlue AccepTor Vector와 연결하고 E. c湖에 형질전환시킨 결과 12개의 흰색 colony를 얻을 수 있었다. 이렇게 얻어진 흰색 colony들이 徴函를 가지고 있는지를 확인하였다.
- 3). Table 2에서 보는 바와 같이 pETBlueUP primer와 pETBlueDOWN primer, 그리고 axeAVJP primer와(队函DOWN primer를 이용한 PCR 결과를 기준으로 상호 비교하여 or函가 정방향으로 삽입된 colony를 구분할 수 있었다. 이 균주와 재조합 plasmid를 각각 재조합균주#4와 pAXEA#4로 명명하였다.
- 3 kDa (1, 008 bp, 334 아미노산)으로 SDS-PAGE에서 관찰된 단백질의 크기와 거의 일치한다. 따라서 38 kDa의 단백질은 AxeA 단백질인 것으로 추정할 수 있었다(Fig. 4, lane 5). 또한 34 kDae S.
- 따라서 본 실험에서 생산된 S. coelicolor A3(2)의 AxeA 전구체 역시 N-말단 부분에 41개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide를 가지고 있으며, -1과 -3 아미노산의 서열이 alanine인 것으로 미루어 E. 에 존재하는 type I signal peptidase가 발현된 AxeA를 절단할 수 있으며 그 부위는 alanine 41과 시Mne 42 잔기 사이일 것으로 추정해 볼 수가 있었다(Fig. 5). 5.
- 2a, lanes 4, 5). 또한 axeA 내부의 약 300bp를 증폭할 수 있는 nested PCR을 시행한 결과에서도 흰색 콜로니로부터 분리된 plasmid를 주형으로 사용하여 PCR을 수행한 경우에만 예상대로 약 300 bp의 PCR 산물이 생성됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 2b). 이상의 결과들을 종합해 볼 때, 형질전환을 통하여 얻어진 12개의 흰색 colony들은 心函가 삽입된 재조합 plasmid를 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 실험실의 연구에서 S. coelicolor A3(2)에서의 esterase 발현은 과산화수소 저항성 인자와 관련되어 있음이 확인되었고, 이는 esterase가 기존에 알려진 고유 기능 이외에 산화적 스트레스에 대한 방어적 기능으로서의 새로운 기능을 가지고 있음을 시사한다고 사료된다(28). 따라서 이번 실험에서는, 방선균의 acetyl xylan esterase와 산화적 스트레스에 관한 관련성을 연구하는 첫 단계로 S.
- 4kb의 크기를 나타낸다. 본 실험의 결과에서도 plasmid 자체의 크기는 3.4 kb임을 확인하였고 (Fig. 2a, lanes 2, 3), 흰색 colony로부터 분리된 plasmid의 크기는 약 4.4 kb임을 관찰할 수 있었다(Fig. 2a, lanes 4, 5). 또한 axeA 내부의 약 300bp를 증폭할 수 있는 nested PCR을 시행한 결과에서도 흰색 콜로니로부터 분리된 plasmid를 주형으로 사용하여 PCR을 수행한 경우에만 예상대로 약 300 bp의 PCR 산물이 생성됨을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 삽입된 DNA의 염기서 열을 분석한 결과 設函는 총 1, 008 bp 의 뉴클레오티드로 구성되어있고 S. coelicolor A3(2) cosmid C- 75A와 100% 일치하며 S. IMms의 areA와 98% 상동성을 갖는 것£로 밝혀졌다(자료 미제시).
- la). 이렇게 준비된 genomic DNA를 주형으로 하여 axeA에 대한 PCR을 수행하였고, 그 결과 약 1 kb의 PCR band를 확인할 수 있었다(Fig. lb).
- 2b). 이상의 결과들을 종합해 볼 때, 형질전환을 통하여 얻어진 12개의 흰색 colony들은 心函가 삽입된 재조합 plasmid를 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.
- coelicolor A3(2)에서 genomic DNA를 주출하였다. 주줄한 DNA 를 0.8% agarose gel에서 확인한 결과 비교적 깨끗한 genomic DNA를 확인할 수 있었다(Fig. la). 이렇게 준비된 genomic DNA를 주형으로 하여 axeA에 대한 PCR을 수행하였고, 그 결과 약 1 kb의 PCR band를 확인할 수 있었다(Fig.
- 5 정도의 log 생장기에는 IFTG 첨가에 의하여 우선 34kDa。] 주로 생산되다가 시간이 경과되면서 38kDa이 같이 생산되었다. 즉 34kDa의 단백질은 IFTG를 첨가하고 2시간 후에 수확한 균체에서 이미 발현되어져 있는 것으로 확인되었고(Fig. 4, lane 3), 38kDa의 단백질은 3시간 후에 수확한 균체에는 적은 양 생산되었으나(Fig. 4, lane 4), 4시간 후에 수확한 경우에는(Fig. 4, lane 5) 38kDa과 34kDa의 단백질이 모두 과량 생산되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
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