선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- Pseudomonas, Bacillus, Flavobacterium, Mycobacterium 등이 해수담수화 공정의 역삼투막에서 주로 발견되는 박테리아 그룹으로 보고되고 있으며,17,21) 보다 효율적인 biofouling 제어를 위해서 이와 같은 바이오필름 형성 미생물의 조기 감지가 중요하다고 판단된다. 본 연구에서는 이를 위한 선행 연구로 역삼투막의 바이오필름으로부터 분석된 박테리아 그룹 중, 고압내성과 부착 능력의 관점에서 바이오 필름 형성을 유발하는 가장 잠재력 있는 박테리아를 선정하고자 하였다.
제안 방법
- 1 mL의 PBS가 담긴 e-tube에 박테리아만 부착된 역삼투막과 박테리아 부착 후 압력을 가한 역삼투막을 각각 넣고 sonicator (BRANSON 5510E-DTH, USA)를 이용하여 10분 동안 표면에 붙은 박테리아를 털어냈다. 직접 계수를 위해, 시료를 10배 희석하여 지름이 25mm인 black polycarbonate membrane (Nuclepore®, USA)으로 여과한 후, 슬라이드 글라스에 올리고 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 약 10분 동안 박테리아를 염색을 하였다.
- 100 MIGD (454,600 m3/day)의 담수를 생산하는 중동에 위치한 실제 해수담수화 플랜트의 해수 원수와 역삼투막에 형성된 바이오필름을 계통발생학적 분석을 위하여 16S rRNA 유전자 클로닝과 염기서열 분석을 시행하였다. 시료의 DNA 추출에는 phenol-chloroform-isoamyl alcohol (PCI; 25:24:1)을 이용한 DNA 추출법14)을 사용하였고, 이때 높은 효율을 위하여 유리 beads를 이용하여 박테리아 세포를 물리적으로 깨주었다.
- 20,21) 이런 고압의 조건에서도 역삼투막에 biofouling현상이 일어나고 있으며, 본 실험에서는 여섯 종의 모델 박테리아에 고압을 가하여 고압내성 특성을 분석하였다. 공기의 압력을 이용하여 역삼투막에 고압을 가할 수 있도록 설계한 dead-end filtration cell의 모식도를 Fig.
- Contact angle goniometer (model 100, Ramé-Hart, Inc. USA)로 물방울을 2 µL를 건조된 모델 박테리아 바이오필름 위에 떨어뜨려 즉시 물방울의 접촉각을 측정하였다.
- 압력 없이 박테리아만 부착시킨 역삼투막과 압력을 가한 역삼투막의 표면 이미지를 SEM (scaning electron microscope, HITACHI S-4700, Japan) 이용하여 비교 관찰하였다. SEM을 위한 전처리로 역삼투막을 2% glutaraldehyde에 2시간 처리하여 박테리아를 고정시키고, 50%, 80%, 90%, 그리고 98% 에탄올에 각각 10분씩 탈수과정을 거친 후 데시케이터에 밤새 건조시켜 수분을 완전히 제거하였다.
- Sonicator를 이용하여 역삼투막으로부터 털어낸 모델 박테리아를 박테리아의 종류에 따라 10∼20배 희석하여 각 시료에서 20L를 고체배지(Table 1)에 도말 하였다.
- 박테리아의 계수를 위하여, DAPI염색 후 형광현미경 관찰을 통한 직접계수법과 지정된 배지를 이용한 평판배양법, 두 가지 방법을 적용하였고, 두 방법의 비교를 통하여 압력을 가한 후 박테리아가 세포의 형태를 유지하고 있지만 생물학적 활성 능력(viability)이 있는지 여부를 분석하였다.
- 서로 다른 모델 박테리아의 역삼투막 부착 능력이 각기 다르고, 이러한 특성이 각각 박테리아 세포의 소수성과 관련이 있는지를 알아보기 위하여 접촉각을 측정해 보았다. 박테리아의 물리화학적 표면특성이 그 박테리아가 막을 비롯한 여러 표면에 부착하는 능력의 연관성을 연구하기 위하여 소수성, 표면자유에너지, 표면 전하와 zeta potential 등을 주로 연구하고 있으며,24) 접촉각 측정을 통해 알 수 있는 표면의 소수성의 변화는 물방울의 각도로 반영되는 표면에너지의 변화와 직접적으로 연관이 있다고 밝혀져 있다.
- 선정된 모델 박테리아 중 가장 막 오염 잠재력을 가진종을 찾아내기 위해 각각 박테리아의 역삼투막 부착 능력, 해수담수화 공정의 고압에 견뎌내는 고압내성 특성을 SEM과 박테리아 계수를 통하여 비교하였고, 모델 박테리아의 소수성을 contact angle goniometer을 이용하여 비교 분석하였다.
- Dead-end filtration cell에 spacer와 미리 모델 박테리아를 부착시켜 놓은 역삼투막을 끼운 후, 실제 해수담수화 공정에서 이용되는 800 psi를 가해 주었다. 압력 없이 박테리아만 부착시킨 역삼투막과 압력을 가한 역삼투막의 표면 이미지를 SEM (scaning electron microscope, HITACHI S-4700, Japan) 이용하여 비교 관찰하였다. SEM을 위한 전처리로 역삼투막을 2% glutaraldehyde에 2시간 처리하여 박테리아를 고정시키고, 50%, 80%, 90%, 그리고 98% 에탄올에 각각 10분씩 탈수과정을 거친 후 데시케이터에 밤새 건조시켜 수분을 완전히 제거하였다.
- 염색된 시료의 이미지 촬영에는 HBO mercury lamp를 light source로 사용하는 CLSM (confocal laser scanning microscope, LSM 5 PASCAL, Carl Zeiss, Germany)을 이용하였으며, 40배 대물 렌즈 (Zeiss, 1.2 W Korr, Germany)로 각 시료당 183.1 × 137 µm2 의 면적을 10군데 이상 무작위로 촬영 후 이미지분석 소프트웨어(i-solution, Korea) 로 박테리아를 계수하였다.
- USA)로 물방울을 2 µL를 건조된 모델 박테리아 바이오필름 위에 떨어뜨려 즉시 물방울의 접촉각을 측정하였다. 이때, 데시케이터에서 건조 시 형성될 수 있는 crack등으로 발생할 수 있는 오차 값을 고려하여, 각 박테리아마다 10번 접촉각을 측정 후 평균을 나타냄으로써 오차를 최소화하였다.
- 이때 PCR 과정은 94℃에서 10분 denaturation 과정을 거친 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분의 과정을 한 사이클로 34번 반복하고, 72℃에서 7분 extension시켰다. 정제된 PCR 산물은 pGEM T-easy cloning kit (RC001, RBC Bioscience, Taiwan)를 이용하여 클로닝 한 후 competent cell에 형질 전환시켰다. Competent cell을 X-gal과 IPTG (isopropyl β-D thiogalactoside)가 포함된 LB agar에 배양하면 흰색과 파란색 콜로니가 형성되며, 형질전환이 잘된 cell은 락토오스 유사 물질인 X-gal을 정상 분해하지 못하여 흰색 콜로니를 형성하게 된다.
- 직접 계수를 위해, 시료를 10배 희석하여 지름이 25mm인 black polycarbonate membrane (Nuclepore®, USA)으로 여과한 후, 슬라이드 글라스에 올리고 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 약 10분 동안 박테리아를 염색을 하였다.
- 추출된 DNA를 일반적인 박테리아의 프라이머로 사용하는 9F (5’-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3’)와 1512R (5’-ACG GHT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)15)을 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 하여 16S rRNA 유전자를 증폭시킨 후, PCR 산물을 정제를 하였다.
- 흰색을 띄는 콜로니만 선별하여 콜로니의 플라스미드를 프라이머 m13F (5’-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3’)와 m13R (5’-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C-3’)로 colony PCR을 한 후 염기서열을 분석하였다.
대상 데이터
- 이외에도 문헌 조사를 통하여 Mycobacterium sp., Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens), Pseudomonas aerugionsa (P. aerugionsa)의 3종의 모델 박테리아를 추가로 선정하였다. Mycobacterium sp.
- Biofouling의 빠른 진단을 위한 센서 개발 연구의 타겟 박테리아로, SWRO에서 역삼투막에 바이오필름을 형성시켜 biofouling 현상을 유발 할 수 있는 박테리아를 선정하여 위하여 여섯 종류의 박테리아를 모델 박테리아로 선정하였다. 모델 박테리아의 역삼투막 부착능력, 고압내성, 소수성 등의 실험을 수행한 결과, 역삼투막 부착능력은 Rhodobacter sp.
- 박테리아 배양에 사용한 고체 배지는 상용화 되어있는 tryptone glucose extract agar (difco 0002), marine agar (difco 0979), R2A agar (difco 1826-17)를 사용하였고, nutrient agar의 경우 nutrient broth (difco 0003-1)에 agar (Junsei, Japan)를 2%가 되게 섞어서 사용하였다. 그리고 실험에 사용된 액체 배지로는 marine broth, nutrient broth를 사용하였고, tryptone glucose extract agar와 R2A agar는 GF/C를 이용하여 agar를 걸러낸 후 배지로 이용하였다.
- , Rhodobacter sp.를 포함, 모두 여섯 종을 실험을 위한 모델 박테리아로 선정하였다.
- 각각의 박테리아는 지정된 배지에 배양 하였으며 그 정보는 Table 1에 나타내었다. 박테리아 배양에 사용한 고체 배지는 상용화 되어있는 tryptone glucose extract agar (difco 0002), marine agar (difco 0979), R2A agar (difco 1826-17)를 사용하였고, nutrient agar의 경우 nutrient broth (difco 0003-1)에 agar (Junsei, Japan)를 2%가 되게 섞어서 사용하였다. 그리고 실험에 사용된 액체 배지로는 marine broth, nutrient broth를 사용하였고, tryptone glucose extract agar와 R2A agar는 GF/C를 이용하여 agar를 걸러낸 후 배지로 이용하였다.
- 본 실험에는 국내 A사에서 제공한 폴리아마이드(polyamide)계로 5,200 GPD (gallons per day)에서 99.65%의 염제거율과, 32,000 ppm NaCl, 800 psi, 25℃, pH 8, 5 ppm boron의 조건에서 boron 제거율이 86%인 역삼투막을 사용하였다.
- 실제 해수담수화 플랜트에서 사용된 해수 원수와 역삼투막에 형성된 바이오필름의 16S rRNA 유전자 클로닝 및 염기서열 분석 결과를 토대로 우점 가능한 대표 박테리아와 문헌 조사를 통하여, 실험을 위한 총 여섯 종의 모델 박테리아를 선정 하였다.
- , 그리고, Firmicutes의 Bacillus sp.을 본 실험을 위한 모델 박테리아로 선정하였다.
- 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 본 연구를 위하여 선정된 여섯 종의 박테리아를 분양 받아 실험을 수행하였다. 각각의 박테리아는 지정된 배지에 배양 하였으며 그 정보는 Table 1에 나타내었다.
이론/모형
- /day)의 담수를 생산하는 중동에 위치한 실제 해수담수화 플랜트의 해수 원수와 역삼투막에 형성된 바이오필름을 계통발생학적 분석을 위하여 16S rRNA 유전자 클로닝과 염기서열 분석을 시행하였다. 시료의 DNA 추출에는 phenol-chloroform-isoamyl alcohol (PCI; 25:24:1)을 이용한 DNA 추출법14)을 사용하였고, 이때 높은 효율을 위하여 유리 beads를 이용하여 박테리아 세포를 물리적으로 깨주었다. 추출된 DNA를 일반적인 박테리아의 프라이머로 사용하는 9F (5’-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3’)와 1512R (5’-ACG GHT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)15)을 이용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 하여 16S rRNA 유전자를 증폭시킨 후, PCR 산물을 정제를 하였다.
- 흰색을 띄는 콜로니만 선별하여 콜로니의 플라스미드를 프라이머 m13F (5’-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3’)와 m13R (5’-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C-3’)로 colony PCR을 한 후 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 후 데이터의 분석은 Kim et al.16)의 방법을 이용하였다.
성능/효과
- 의 순서대로 상대적으로 높은 감소율을 보였다. P. fluorescens는 감소율이 1%, 29%로 가장 고압내성이 큰 박테리아로 관찰되었다.
- 여섯 종류의 모델 박테리아 중 Mycobacterium sp.가 역삼투막에 잘 부착되며, 소수성이 가장 크고, 800 psi의 고압을 가한 후에도 50% 이상의 생물학적 활성 능력을 보여 역삼투막에 바이오필름을 형성하는 비교적 잠재력이 있는 박테리아로 사료된다. Biofouling의 빠른 진단을 위한 센서 개발 연구의 타겟 박테리아 선정을 위한 추가적인 정보를 수집하기 위하여, 역삼투막 부착 능력과 소수성 측정, 고압내성 실험 이외에 SWRO 공정의 전처리 과정 중 antiscalant와 disinfection시 사용하는 화학약품에 대한 여섯 종류의 모델 박테리아의 저항능력을 여러 조건(pH, 온도 등)하에서 평가하는 등의 연구가 추가로 필요하다.
- 는 고압에 잘 견디지 못하고 59∼73%의 가장 큰 감소율을 보였으며, P. fluorescens가 1∼29%로 가장 고압내성이 큰 박테리아로 분석되었다.
- 5와 6에 나타내었다. 시료에 DAPI 형광염색을 한 후 CLSM을 이용하여 박테리아를 직접 계수한 결과(Fig. 4)와 평판배양법을 이용하여 지정된 배지(Table 1)에 박테리아를 도말하여 CFU를 계수한 결과(Fig. 5)는 비교적 비슷한 양상을 보이고 있었다. 본 실험에서 모델 박테리아가 부착된 역삼투막에 압력을 가하지 않은 것을 ‘control’, 800 psi의 압력을 가한 것을 ‘sample’로 표기하였다.
- 원수에서 분석된 박테리아 중 uncultured bacteria를 제외하고 Bacteroidetes (22%)와 Alphaproteobacteria (20%)가 가장 많은 부분을 차지하였고, 역삼투막의 바이오필름에 형성된 박테리아 분석 결과, 이외에도 Firmicutes의 Bacillales 가 6%로 분석되었다. 이중 원수의 Bacteroidetes의 87.
- 원수에서 분석된 박테리아 중 uncultured bacteria를 제외하고 Bacteroidetes (22%)와 Alphaproteobacteria (20%)가 가장 많은 부분을 차지하였고, 역삼투막의 바이오필름에 형성된 박테리아 분석 결과, 이외에도 Firmicutes의 Bacillales 가 6%로 분석되었다. 이중 원수의 Bacteroidetes의 87.5%가 Flavobacteria로, Alphaproteobacteria 중에서는 Rhodobacteraceae가 46.67%로 가장 많은 부분을 차지하고 있었다 (데이터는 나타내지 않음). 분석된 결과(Table 2)를 근거로 하여 Bacteroidetes의 Flavobacteria sp.
- 직접계수법과 평판배양법을 이용한 계수법 모두에서 800 psi의 압력을 가해준 후의 여섯 종류의 모든 박테리아에서 그 수가 줄어들었음을 관찰 할 수 있었으나, 모델 박테리아 마다 감소율의 차이는 있었다. 두 방법을 이용한 계수법에서, 각각의 모델 박테리아가 부착되어있는 역삼투막에 800 psi의 압력을 가한 후에 Rhodobacter sp.
- 한편, 이와 같이 직접계수법과 평판배양법에서 여섯 종류 모델 박테리아의 감소율의 양상은 같은 반면에, 각각의 모델 박테리아를 기준으로 직접계수법과 평판배양법을 이용한 계수 결과에는 다소 차이가 있었다. 특히 Mycobacterium sp.
후속연구
- 가 역삼투막에 잘 부착되며, 소수성이 가장 크고, 800 psi의 고압을 가한 후에도 50% 이상의 생물학적 활성 능력을 보여 역삼투막에 바이오필름을 형성하는 비교적 잠재력이 있는 박테리아로 사료된다. Biofouling의 빠른 진단을 위한 센서 개발 연구의 타겟 박테리아 선정을 위한 추가적인 정보를 수집하기 위하여, 역삼투막 부착 능력과 소수성 측정, 고압내성 실험 이외에 SWRO 공정의 전처리 과정 중 antiscalant와 disinfection시 사용하는 화학약품에 대한 여섯 종류의 모델 박테리아의 저항능력을 여러 조건(pH, 온도 등)하에서 평가하는 등의 연구가 추가로 필요하다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.