[논문]초기 계대 인간 배아줄기세포의 해동 후 효율적인 배양 방법

백진아; 김희선; 설혜원; 서진; 정주원; 윤보애; 박용빈; 오선경; 구승엽; 김석현; 최영민; 문신용

초기 계대 인간 배아줄기세포의 해동 후 효율적인 배양 방법
Efficient Culture Method for Early Passage hESCs after Thawing 원문보기

대한생식의학회지= The Korean journal of reproductive medicine, v.36 no.4, 2009년, pp.311 - 319

초록
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목 적: 인간 배아줄기세포 (human embryonic stem cells; hESCs)는 미분화 상태로 무한 증식할 수 있는 자가 증식(self-renewal) 능력과 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency)의 특징을 가진 세포로, 손상된 세포를 건강한 세포로 대체하고자 하는 세포치료 (cell therapy) 연구에 활용하기 위한 세포 공급원 (cell source)으로 제시되고 있다. 그러나 인간 배아줄기세포는 확립된 초기에 세포를 안정적으로 배양하고 유지하는 과정이 쉽지 않으며, 특히 동결보존되어 있던 세포를 해동한 후 배양할 때 자연 발생적 분화가 높기 때문에 세포주의 유지에 많은 어려움이 따른다. 본 연구에서는 동결보존되어 있던 초기 계대의 인간 배아줄기세포를 해동하여 다시 배양할 때 자연 발생적 분화 부분을 기계적 분리 방법으로 제거하여 미분화 상태의 세포를 보다 빠르게 확보하기 위한 효율적인 방법에 대해 알아보고자 하였다. 연구방법: 인간 배아줄기세포를 계대 배양한지 4일이 되는 날, 50% 이상의 자연 발생적 분화가 나타난 세포군에서 분화된 부분만을 절개용 유리 피펫 (drawn-out dissecting pasture pipette)을 사용하여 기계적인 방법으로 제거하였다. 이후 지속적으로 배양액을 교환해 주며 세포군의 제거된 부분을 7일째 되는 날까지 관찰하였다. 결 과: 기계적 분리 방법을 사용하여 인간 배아줄기세포의 자연 발생적인 분화 부분을 제거한 빈 공간에 미분화상태의 인간 배아줄기세포가 분열하여 채워지는 것을 관찰하였다. 또한, 이 실험 방법을 연속 두 번 적용하여 배양했을 때 미분화 세포로 회복되는 세포군의 비율이 조금 더 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 결 론: 동결되어 있던 초기 계대 인간 배아줄기세포의 해동 후, 자연 발생적 분화에 의해 미분화 상태를 유지하는 세포의 수가 적어 계대를 유지 하기가 어려울 때 이와 같은 기계적 분리 방법을 사용하여 자연 발생적 분화 부분을 제거한 후 배양을 지속하는 것이 단기간 내에 미분화 상태를 유지하는 인간 배아줄기세포의 양적 확보를 위한 효율적인 방법이라고 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Objective: Human embryonic stem cells (hESCs) have the capacity to differentiate into all of the cell types and therefore hold promise for cell therapeutic applications. In order to utilize this important potential of hESCs, enhancement of currently used technologies for handling and manipulating the cells is required. The cryopreservation of hESC colonies was successfully performed using the vitrification and slow freezing-rapid thawing method. However, most of the hESC colonies were showed extremely spontaneous differentiation after freezing and thawing. In this study, we were performed to rapidly collect of early passage hESCs, which was thawed and had high rate of spontaneously differentiation of SNUhES11 cell line. Methods: Four days after plating, partially spontaneously differentiated parts of hESC colony were cut off using finely drawn-out dissecting pipette, which is mechanical separation method. Results: After separating of spontaneously differentiated cells, we observed that removed parts were recovered by undifferentiated cells. Furthermore, mechanical separation method was more efficient for hESCs expansion after thawing when we repeated this method. The recovery rate after removing differentiated parts of hESC colonies were 55.0%, 74.5%, and 71.1% when we have applied this method to three passages. Conclusion: Mechanical separation method is highly effective for rapidly collecting and large volumes of undifferentiated cells after thawing of cryopreserved early passage hESCs.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 초자화동결 또는 완만동결-급속융해와 같은 방법으로 냉동보존되어 있던 초기 계대의 인간 배아줄기세포를 해동하여 다시 배양할 때 자연 발생적 분화 부분을 절개용 유리 피펫을 사용하여 기계적인 방법으로 분리한 후 제거하여 미분화를 유지하는 인간 배아줄기세포를 빠른 시기에 보다 많은 양을 확보하기 위한 효율적인 방법에 대해 알아보고자 하였다.
본 논문에서는 이러한 어려움을 극복하여 해동 후 미분화 상태의 초기 계대 인간 배아줄기세포를 다량으로 확보하는 기간을 단축하기 위해 배양 시 자연 발생적 분화 부분을 기계적인 방법으로 분리하여 제거하는 방법을 시도하였다. 초기 계대에서 초자화동결 방법으로 보관되어 있던 인간 배아줄기세포는 매우 소량이었으며, 해동 직후의 인간 배아줄기세포는 최초 몇 계대를 유지할 때 자연 발생적 분화가 매우 심하기 때문에 미분화 상태를 유지하고 있는 부분만 잘라내어 3~5일 간격으로 계대 배양을 하였음에도 불구하고, 대다수의 세포 군은 한 세포군의 약 80% 이상 되는 자연 발생적 분화가 이루어져 온전한 미분화 상태의 세포군을 얻기가 어려웠다.

제안 방법

계대를 넘겨 배양을 한지 2일이 되는 날부터 배양접시의 배양액을 교환하여 주고, 4일이 되었을 때 부착되어 자라난 세포군 중에서 자연 발생적 분화가 50% 이상 나타난 세포군의 분화된 부분만을 Oh 등의 방법에 따른 절개용 유리 피펫 (drawn-out dissecting pasture pipette)을 사용하여 기계적인 방법으로 제거하였다.¹⁷ 절개용 유리 피펫은 초음파 세척기를 이용하여 3번 세척한 후 습윤 멸균한 9-인치 유리 피펫에 열을 가하여 가늘게 뽑아 그 끝을 갈고리 모양으로 만들었고, 이를 이용하여 현미경 아래에서 세포군의 미분화 상태의 세포와 자연 발생적 분화가나타난 세포의 경계 부분을 확인하며 갈고리 모양의 둥근 부분으로 잘라내었다. 이후 지속적으로 배양액을 교환해 주며 세포군의 제거된 부분을 7일째 되는 날까지 관찰하였으며, 이와 같은 방법으로 세 번의 계대를 넘기며 전체 300개의 세포군을 실험하였다.
이후 1차 항체를 4℃에서 12시간 이상 처리한 다음 D-PBS로 세 번 세척한 후, 2차 항체인 Alexa Fluor 488-labelled donkey anti-mouse IgG와 Alexa Fluor 594-labelled donkey anti-mouse IgG (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) 를 상온에서 1시간 처리하였다. 2차 항체까지 처리한 슬라이드를 DAPI가 포함된 Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)로 도포한 후 형광현미경 (Eclipse 80i, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
3 배양액으로는 Dulbecco's modified eagle medium nutrient mixture F-12 (DMEM/ F12; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 20% KnockOut Serum Replacement (Ko-SR; Invitrogen, San Diego, CA, USA)와 1% non-essential amino acid (NEAA; Invitrogen, San Diego, CA, USA), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO, USA), 4 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF; invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 그리고 0.5% penicillin/streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 사용하였고, Mitomycin C (Sigma, St Louis, MO, USA)를 처리한 생쥐 배아섬유 세포 (STO, CRL-1503; ATCC, Manassas, VA, USA)를 영양세포로 사용한 배양접시에 배양하였다.
그 이후 초기 계대의 미분화 세포를 빠른 시기에 다량으로 확보하기 위해서 기계적 분리 방법을 사용하였다. Figure 1에서 보는 것과 같이 계대를 넘긴지 4일 째 되는 날에 세포군에서 자연 발생적 분화가 심한 부분을 절개용 유리 피펫으로 기계적인 방법을 사용하여 분리하였다. 잘라낸 자연 발생적 분화 부분은 배양액을 교환할 때 동시에 제거하였고, 이후에는 일반적인 배양 방법과 같이 매일 배양접시의 배양액을 교환 해주며 지속적으로 배양하였다.
인간 배아줄기세포주 SNUhES11 (p5+7)의 세포군에서 미분화를 유지하고 있는 부분을 기계적인 방법을 사용하여 약 100개의 세포덩어리로 잘라내어 새로운 STO 영양세포 배양접시에 적당한 간격으로 배치하며 계대를 넘겼다 (p5+8). 계대를 넘겨 배양을 한지 2일이 되는 날부터 배양접시의 배양액을 교환하여 주고, 4일이 되었을 때 부착되어 자라난 세포군 중에서 자연 발생적 분화가 50% 이상 나타난 세포군의 분화된 부분만을 Oh 등의 방법에 따른 절개용 유리 피펫 (drawn-out dissecting pasture pipette)을 사용하여 기계적인 방법으로 제거하였다.¹⁷ 절개용 유리 피펫은 초음파 세척기를 이용하여 3번 세척한 후 습윤 멸균한 9-인치 유리 피펫에 열을 가하여 가늘게 뽑아 그 끝을 갈고리 모양으로 만들었고, 이를 이용하여 현미경 아래에서 세포군의 미분화 상태의 세포와 자연 발생적 분화가나타난 세포의 경계 부분을 확인하며 갈고리 모양의 둥근 부분으로 잘라내었다.
초자화동결 방법으로 보존되어 있던 인간 배아줄기세포주 SNUhES11 중 5계대 (p5)의 세포덩어리 (clump) 19개를 해동한 후 세포의 안정화와 동시에 실험에 사용할 수 있는 최소의 세포 수를 확보하기 위해서 기계적인 방법을 사용하여 3~5일 간격으로 7번 (p5+7)의 계대를 넘겼다. 그 이후 초기 계대의 미분화 세포를 빠른 시기에 다량으로 확보하기 위해서 기계적 분리 방법을 사용하였다. Figure 1에서 보는 것과 같이 계대를 넘긴지 4일 째 되는 날에 세포군에서 자연 발생적 분화가 심한 부분을 절개용 유리 피펫으로 기계적인 방법을 사용하여 분리하였다.
기계적인 방법으로 자연 발생적 분화 부분을 분리하여 제거한 후 3일 동안 배양된 세포군이 점착되어 있는 슬라이드를 4% Paraformaldehyde (USB, Cleveland, OH, USA)로 상온에서 30분간 고정하고, Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 한 번 세척한 후 0.05% tween-twenty (Sigma, St Louis, MO, USA)와 3% Bovine serum albumin (BSA; Sigma, St Louis, MO, USA)을 1:1 비율로 섞어 4℃에서 12시간 이상 처리하였다.
05% tween-twenty (Sigma, St Louis, MO, USA)와 3% Bovine serum albumin (BSA; Sigma, St Louis, MO, USA)을 1:1 비율로 섞어 4℃에서 12시간 이상 처리하였다. 이후 1차 항체를 4℃에서 12시간 이상 처리한 다음 D-PBS로 세 번 세척한 후, 2차 항체인 Alexa Fluor 488-labelled donkey anti-mouse IgG와 Alexa Fluor 594-labelled donkey anti-mouse IgG (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) 를 상온에서 1시간 처리하였다. 2차 항체까지 처리한 슬라이드를 DAPI가 포함된 Vectashield (Vector Laboratories, Inc.
자연 발생적 분화 부분을 절개용 유리 피펫을 사용하여 기계적인 방법으로 분리하여 제거한 후에 배양된 세포군이 인간 배아줄기세포의 특성을 지속하는지를 확인하기 위해 항원-항체 반응을 이용한 면역세포화학 염색 방법 (immunocytochemistry)을 사용하였다. 인간 배아줄기세포의 미분화를 유지하는 세포에서 높게 발현된다고 알려진 전사인자 Oct-4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 세포표면 표식인자인 SSEA-4 (Millipore, Billerica, MA, USA), Tra-1-60 (Millipore, Billerica, MA, USA), 그리고 Tra-1-81 (Millipore, Billerica, MA, USA) 단백질을 염색하여 발현 여부를 관찰하였다. 기계적인 방법으로 자연 발생적 분화 부분을 분리하여 제거한 후 3일 동안 배양된 세포군이 점착되어 있는 슬라이드를 4% Paraformaldehyde (USB, Cleveland, OH, USA)로 상온에서 30분간 고정하고, Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 한 번 세척한 후 0.
인간 배아줄기세포주 SNUhES11 (p5+7)의 세포군에서 미분화를 유지하고 있는 부분을 기계적인 방법을 사용하여 약 100개의 세포덩어리로 잘라내어 새로운 STO 영양세포 배양접시에 적당한 간격으로 배치하며 계대를 넘겼다 (p5+8). 계대를 넘겨 배양을 한지 2일이 되는 날부터 배양접시의 배양액을 교환하여 주고, 4일이 되었을 때 부착되어 자라난 세포군 중에서 자연 발생적 분화가 50% 이상 나타난 세포군의 분화된 부분만을 Oh 등의 방법에 따른 절개용 유리 피펫 (drawn-out dissecting pasture pipette)을 사용하여 기계적인 방법으로 제거하였다.
5% penicillin/streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 사용하였고, Mitomycin C (Sigma, St Louis, MO, USA)를 처리한 생쥐 배아섬유 세포 (STO, CRL-1503; ATCC, Manassas, VA, USA)를 영양세포로 사용한 배양접시에 배양하였다. 초기계대에서 초자화동결 방법으로 동결된 인간 배아 줄기세포는 매우 소량이며, 또한 해동 직후의 인간 배아줄기세포는 최초 몇 계대를 유지할 때 자연 발생적 분화가 매우 심하기 때문에 계대를 유지하기 위해서 기계적인 방법 (mechanical transfer)으로 미분화 상태를 유지하고 있는 부분만 잘라내어 3~5일 간격으로 새로운 STO 영양세포 배양접시에 옮겨 세포주 SNUhES11이 유지될 수 있도록 하였고, 이러한 방법으로 7번 (p5+7)의 계대를 넘기며 안정화 하는 동시에, 본 실험에 사용하기 위한 최소한의 인간 배아줄기세포를 확보하였다.
초자화동결 방법으로 보존되어 있던 인간 배아줄기세포주 SNUhES11 중 5계대 (p5)의 세포덩어리 (clump) 19개를 해동한 후 세포의 안정화와 동시에 실험에 사용할 수 있는 최소의 세포 수를 확보하기 위해서 기계적인 방법을 사용하여 3~5일 간격으로 7번 (p5+7)의 계대를 넘겼다. 그 이후 초기 계대의 미분화 세포를 빠른 시기에 다량으로 확보하기 위해서 기계적 분리 방법을 사용하였다.

대상 데이터

본 연구에는 서울대학교 인구의학연구소에서 확립된 인간 배아줄기세포주 SNUhES11을 사용하였다. 확립한 후 5계대 (passage 5; p5)까지 배양한 다음 초자화동결 방법으로 냉동보관하고 있던 세포 중 19개의 세포덩어리 (clumps)를 녹여, Oh 등의 방법에 따라 배양하였다.
¹⁷ 절개용 유리 피펫은 초음파 세척기를 이용하여 3번 세척한 후 습윤 멸균한 9-인치 유리 피펫에 열을 가하여 가늘게 뽑아 그 끝을 갈고리 모양으로 만들었고, 이를 이용하여 현미경 아래에서 세포군의 미분화 상태의 세포와 자연 발생적 분화가나타난 세포의 경계 부분을 확인하며 갈고리 모양의 둥근 부분으로 잘라내었다. 이후 지속적으로 배양액을 교환해 주며 세포군의 제거된 부분을 7일째 되는 날까지 관찰하였으며, 이와 같은 방법으로 세 번의 계대를 넘기며 전체 300개의 세포군을 실험하였다.

이론/모형

자연 발생적 분화 부분을 절개용 유리 피펫을 사용하여 기계적인 방법으로 분리하여 제거한 후에 배양된 세포군이 인간 배아줄기세포의 특성을 지속하는지를 확인하기 위해 항원-항체 반응을 이용한 면역세포화학 염색 방법 (immunocytochemistry)을 사용하였다. 인간 배아줄기세포의 미분화를 유지하는 세포에서 높게 발현된다고 알려진 전사인자 Oct-4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 세포표면 표식인자인 SSEA-4 (Millipore, Billerica, MA, USA), Tra-1-60 (Millipore, Billerica, MA, USA), 그리고 Tra-1-81 (Millipore, Billerica, MA, USA) 단백질을 염색하여 발현 여부를 관찰하였다.
본 연구에는 서울대학교 인구의학연구소에서 확립된 인간 배아줄기세포주 SNUhES11을 사용하였다. 확립한 후 5계대 (passage 5; p5)까지 배양한 다음 초자화동결 방법으로 냉동보관하고 있던 세포 중 19개의 세포덩어리 (clumps)를 녹여, Oh 등의 방법에 따라 배양하였다.³ 배양액으로는 Dulbecco's modified eagle medium nutrient mixture F-12 (DMEM/ F12; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 20% KnockOut Serum Replacement (Ko-SR; Invitrogen, San Diego, CA, USA)와 1% non-essential amino acid (NEAA; Invitrogen, San Diego, CA, USA), 0.

성능/효과

^7~11예를 들면, 인간 배아줄기세포는 오랜 기간 배양할수록 세포의 자가 증식률은 증가하지만 다양한 세포로의 분화 능력은 감소한다는 보고가 있으며, 7~917번 염색체의 장완 이상, 12번 염색체 이상, 그리고 X염색체와 그 밖에 다른 여러 염색체의 이상을 확인하며 이러한 염색체 이상을 가진 인간 배아줄기세포는 유전자 변화로 인한 세포의 성장률이 높아진다고 보고된 바 있다.^10,11 이러한 보고들을 종합해 보면, 인간 배아줄기세포를 이용한 분화 연구에는 오랜 기간 배양해온 세포보다 초기 계대의 세포를 이용하는 것이 더욱 효율적이라는 것을 알 수 있다. 때문에 초기 계대의 인간 배아줄기세포는 초자화동결 또는 완만동결-급속융해와 같은 냉동 보존 방법으로 보관하게 되며, 인간 배아줄기세포가 연구에 필요한 경우 보관되어 있던 세포를 다시 해동, 배양하고 그 수를 증식하여 연구에 사용하게 된다.
잘라낸 자연 발생적 분화 부분은 배양액을 교환할 때 동시에 제거하였고, 이후에는 일반적인 배양 방법과 같이 매일 배양접시의 배양액을 교환 해주며 지속적으로 배양하였다. 그 결과, 자연 발생적인 분화 부분을 기계적인 방법으로 잘라내어 경계가 뚜렷하게 보였던 빈 공간에 미분화 상태의 인간 배아줄기세포가 분열하여 미분화 세포들로 채워지는 것을 관찰하였다 (Figure 1).
초기 계대에서 초자화동결 방법으로 보관되어 있던 인간 배아줄기세포는 매우 소량이었으며, 해동 직후의 인간 배아줄기세포는 최초 몇 계대를 유지할 때 자연 발생적 분화가 매우 심하기 때문에 미분화 상태를 유지하고 있는 부분만 잘라내어 3~5일 간격으로 계대 배양을 하였음에도 불구하고, 대다수의 세포 군은 한 세포군의 약 80% 이상 되는 자연 발생적 분화가 이루어져 온전한 미분화 상태의 세포군을 얻기가 어려웠다. 그러나 기계적 분리 방법을 사용하여 자연 분화된 부분을 기계적으로 잘라내 제거한 다음 지속적으로 배양을 하였더니 자연 분화된 세포들을 제거한 부분에 미분화 상태의 세포가 채워져서 완전한 미분화 세포군이 되는 것을 확인할 수 있었다. 이후의 계대 배양에서 이와 같은 방법을 다시 한 번 적용한 결과 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로 채워진 세포군들이 약 55%에서 75%로 증가하였으며, 자연 분화된 세포를 포함하고 있는 세포군은 현저하게 감소하는 것을 확인할 수있었다.
이러한 결과로 볼 때, 해동 직후 초기 배양 시 미분화 세포만을 선택하여 계대 배양할 경우 다량의 미분화 세포군을 확보하기까지 많은 시간이 필요하지만 본 논문의 방법을 이용하여 배양하는 경우에는 약 3계대 이내의 짧은 시간 안에 다량의 미분화 세포군을 확보 하여 비교적 초기 계대의 인간 배아줄기세포를 분화연구에 활용할 수 있음을 보여주고 있다. 따라서 본 논문의 방법을 이용할 경우에는 해동 후의 인간 배아줄기세포가 초기 계대일 때에도 미분화를 유지하는 세포의 양적 확보가 용이하기 때문에 신경계세포, 췌장세포 또는 심근세포 등의 분화 유도 실험을 하기 위한 적절한 세포를 수적 제한 없이 초기 계대에 공급할 수 있다는 데 의의가 있겠다.
7% (101/300)는 제거된 부분에 인간 배아줄기세포가 채워진 후 다시 자연 발생적 분화가 일어나는 것을 관찰하였다. 또한 기계적인 방법으로 자연 발생적 분화 부분을 분리하여 제거하는 실험 방법을 연속적으로 적용하여 계대배양을 지속하며 관찰했을 때, 미분화 상태를 회복 하는 비율이 55.0%에서 74.5%로 높아지는 것으로 보아 확립되어 얼마 되지 않아 매우 적은 양이 있는 초기 계대의 인간 배아줄기세포를 해동한 직후 미분화 상태를 유지하는 세포를 빠른 시간 내에 다량으로 얻고자 할 경우 매우 유용한 방법임을 확인할 수 있었다 (Table 1).
본 연구에서는 초기 계대 인간 배아줄기세포의 해동 후 미분화 세포의 빠른 확보를 위하여 계대를 넘긴 후 4일 째 되는 날에 자연 발생적으로 분화가 된 부분을 절개용 유리 피펫을 사용하여 기계적인 방법으로 제거한 후 지속적으로 배양액을 교환하며 관찰한 결과, 그렇지 않은 실험군에 비해 미분화를 유지하는 세포군이 많은 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 실험 방법을 연속적으로 적용 했을 때 미분화 상태를 유지하는 인간 배아줄기세포의 비율이 55.0%에서 74.5%로 효율이 더욱 높아지는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 보아 동결되어 있던 초기 계대 인간 배아줄기세포의 해동 직후, 자연 발생적 분화에 의해 미분화 상태를 유지하는 세포의 수가 적어 계대 유지가 어려울 때 이와 같은 기계적인 방법으로 자연 발생적 분화 부분을 제거한 후 배양을 지속하는 것이 빠른 기간 안에 미분화 상태를 유지하는 인간 배아줄기세포의 양적 확보를 위한 효율적인 방법이라고 사료된다.
또한, 자연 발생적인 분화 부분을 제거한 공간에 새로이 채워진 세포가 미분화 세포의 특성을 지속적으로 유지하는 인간 배아줄기세포인지를 면역세포화학 염색 방법으로 확인한 결과 전사인자 Oct-4와 세포표면 표식인자인 SSEA-4, Tra-1-60 그리고 Tra-1-81 단백질이 모두 발현하며 인간 배아줄기세포의 미분화 특성을 지속적으로 유지하고 있는 것을 확인하였다 (Figure 3).
본 연구에서는 초기 계대 인간 배아줄기세포의 해동 후 미분화 세포의 빠른 확보를 위하여 계대를 넘긴 후 4일 째 되는 날에 자연 발생적으로 분화가 된 부분을 절개용 유리 피펫을 사용하여 기계적인 방법으로 제거한 후 지속적으로 배양액을 교환하며 관찰한 결과, 그렇지 않은 실험군에 비해 미분화를 유지하는 세포군이 많은 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 실험 방법을 연속적으로 적용 했을 때 미분화 상태를 유지하는 인간 배아줄기세포의 비율이 55.
5%로 효율이 더욱 높아지는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 보아 동결되어 있던 초기 계대 인간 배아줄기세포의 해동 직후, 자연 발생적 분화에 의해 미분화 상태를 유지하는 세포의 수가 적어 계대 유지가 어려울 때 이와 같은 기계적인 방법으로 자연 발생적 분화 부분을 제거한 후 배양을 지속하는 것이 빠른 기간 안에 미분화 상태를 유지하는 인간 배아줄기세포의 양적 확보를 위한 효율적인 방법이라고 사료된다.
이러한 방법을 두 번 연속으로 수행한 이후의 계대에 일반적인 계대 배양 방법을 적용한결과, 자연 발생적 분화를 보이는 세포군은 상당히 감소하였으며 다량의 미분화 상태 인간 배아줄기세포를 확보할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때, 해동 직후 초기 배양 시 미분화 세포만을 선택하여 계대 배양할 경우 다량의 미분화 세포군을 확보하기까지 많은 시간이 필요하지만 본 논문의 방법을 이용하여 배양하는 경우에는 약 3계대 이내의 짧은 시간 안에 다량의 미분화 세포군을 확보 하여 비교적 초기 계대의 인간 배아줄기세포를 분화연구에 활용할 수 있음을 보여주고 있다. 따라서 본 논문의 방법을 이용할 경우에는 해동 후의 인간 배아줄기세포가 초기 계대일 때에도 미분화를 유지하는 세포의 양적 확보가 용이하기 때문에 신경계세포, 췌장세포 또는 심근세포 등의 분화 유도 실험을 하기 위한 적절한 세포를 수적 제한 없이 초기 계대에 공급할 수 있다는 데 의의가 있겠다.
이후의 계대 배양에서 이와 같은 방법을 다시 한 번 적용한 결과 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로 채워진 세포군들이 약 55%에서 75%로 증가하였으며, 자연 분화된 세포를 포함하고 있는 세포군은 현저하게 감소하는 것을 확인할 수있었다. 이러한 방법을 두 번 연속으로 수행한 이후의 계대에 일반적인 계대 배양 방법을 적용한결과, 자연 발생적 분화를 보이는 세포군은 상당히 감소하였으며 다량의 미분화 상태 인간 배아줄기세포를 확보할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때, 해동 직후 초기 배양 시 미분화 세포만을 선택하여 계대 배양할 경우 다량의 미분화 세포군을 확보하기까지 많은 시간이 필요하지만 본 논문의 방법을 이용하여 배양하는 경우에는 약 3계대 이내의 짧은 시간 안에 다량의 미분화 세포군을 확보 하여 비교적 초기 계대의 인간 배아줄기세포를 분화연구에 활용할 수 있음을 보여주고 있다.
그러나 기계적 분리 방법을 사용하여 자연 분화된 부분을 기계적으로 잘라내 제거한 다음 지속적으로 배양을 하였더니 자연 분화된 세포들을 제거한 부분에 미분화 상태의 세포가 채워져서 완전한 미분화 세포군이 되는 것을 확인할 수 있었다. 이후의 계대 배양에서 이와 같은 방법을 다시 한 번 적용한 결과 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로 채워진 세포군들이 약 55%에서 75%로 증가하였으며, 자연 분화된 세포를 포함하고 있는 세포군은 현저하게 감소하는 것을 확인할 수있었다. 이러한 방법을 두 번 연속으로 수행한 이후의 계대에 일반적인 계대 배양 방법을 적용한결과, 자연 발생적 분화를 보이는 세포군은 상당히 감소하였으며 다량의 미분화 상태 인간 배아줄기세포를 확보할 수 있었다.
자연 발생적 분화 부분을 기계적 분리 방법으로 제거한 후 지속적으로 관찰한 결과 p5+8에서는 109개 세포군 중 55.0% (60/109), p5+9의 94개 세포군 중 74.5% (70/94), p5+10의 97개 세포군 중 71.1% (69/97)는 자연 발생적 분화 부분이 제거된 빈자리에 인간 배아줄기세포가 채워져 미분화 상태의 세포군을 지속적으로 유지하는 것을 확인하였다. 반면 전체의 33.
세포군에서 자연 발생적 분화 부분을 제거한 세포군과 제거하지 않은 세포군을 비교 관찰했을때 이러한 경향을 다시 한 번 확인할 수 있었다 (Figure 2). 자연 발생적 분화 부분을 제거한 후 배양한 세포군의 거의 모든 부분은 미분화 세포로 채워져 정상적인 미분화 세포군을 형성하였으나(Figure 2, left colony), 분화 부분을 제거하지 않고 배양을 지속한 세포군은 80% 이상 되는 거의 모든 부분에서 자연 발생적 분화가 일어났으며 새로운 STO 영양세포 배양접시로 계대를 넘길만한 미분화 상태의 세포가 적어 계대 유지가 어려워진 것을 확인할 수 있었다 (Figure 2, right colony).

후속연구

1~3 최근에는 파킨슨씨병 (Parkinson's disease)과 같은 퇴행성 질환이나 당뇨 및 심근경색 등과 같은 난치병 치료를 위하여 인간 배아줄기세포를 신경계세포 (neurons), 췌장세포 (pancreatic β cells) 또는 심근세포 (cardiomyocytes) 등의 다양한 종류의 세포로 분화를 유도하는 연구가 진행되고 있으며 이렇게 분화된 인간 배아줄기세포를 손상된 세포를 건강한 세포로 대체하고자 하는 세포치료 (cell therapy) 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
^10,11 이러한 보고들을 종합해 보면, 인간 배아줄기세포를 이용한 분화 연구에는 오랜 기간 배양해온 세포보다 초기 계대의 세포를 이용하는 것이 더욱 효율적이라는 것을 알 수 있다. 때문에 초기 계대의 인간 배아줄기세포는 초자화동결 또는 완만동결-급속융해와 같은 냉동 보존 방법으로 보관하게 되며, 인간 배아줄기세포가 연구에 필요한 경우 보관되어 있던 세포를 다시 해동, 배양하고 그 수를 증식하여 연구에 사용하게 된다.^12,13

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	인간 배아줄기세포는 초기에 어떻게 보존하는가?	그러나 인간 배아줄기세포는 확립된 직후의 초기 계대에는 그 세포 수가 매우 적고 한정적이기 때문에 세포주의 소실을 막기 위해서는 적절한 방법으로 보존하는 것이 매우 중요하다. 이를 위하여 일반적으로 초자화동결 (vitrification) 또는 완만동결-급속융해 (slow freezing-rapid thawing)와 같은 냉동보존 방법을 사용하여 세포를 확보한다.12,13 그러나 Yang 등의 보고에 의하면 초자화동결과 같은 냉동보존 방법의 경우에는 해동 후 생존률이 88.
	인간 배아줄기세포를 연구에 활용하기 힘든 이유는 무엇 때문인가?	목 적: 인간 배아줄기세포 (human embryonic stem cells; hESCs)는 미분화 상태로 무한 증식할 수 있는 자가 증식(self-renewal) 능력과 인체의 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency)의 특징을 가진 세포로, 손상된 세포를 건강한 세포로 대체하고자 하는 세포치료 (cell therapy) 연구에 활용하기 위한 세포 공급원 (cell source)으로 제시되고 있다. 그러나 인간 배아줄기세포는 확립된 초기에 세포를 안정적으로 배양하고 유지하는 과정이 쉽지 않으며, 특히 동결보존되어 있던 세포를 해동한 후 배양할 때 자연 발생적 분화가 높기 때문에 세포주의 유지에 많은 어려움이 따른다. 본 연구에서는 동결보존되어 있던 초기 계대의 인간 배아줄기세포를 해동하여 다시 배양할 때 자연 발생적 분화 부분을 기계적 분리 방법으로 제거하여 미분화 상태의 세포를 보다 빠르게 확보하기 위한 효율적인 방법에 대해 알아보고자 하였다.
	착상 전 포배기 (blastocyst)의 내세포괴 (inner cell mass)로부터 유래된 인간 배아줄기세포의 특징은?	착상 전 포배기 (blastocyst)의 내세포괴 (inner cell mass)로부터 유래된 인간 배아줄기세포 (human embryonic stem cells; hESCs)는 미분화 상태를 유지하며 무한 증식할 수 있는 자가 증식 (self-renewal) 능력과 인체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotency)의 특징을 가진 세포로, 1998년에 Thomson 등에 의해 처음으로 확립 (derivation)된 이후 이를 이용한 여러 가지 연구가 계속되고 있다.1~3 최근에는 파킨슨씨병 (Parkinson's disease)과 같은 퇴행성 질환이나 당뇨 및 심근경색 등과 같은 난치병 치료를 위하여 인간 배아줄기세포를 신경계세포 (neurons), 췌장세포 (pancreatic β cells) 또는 심근세포 (cardiomyocytes) 등의 다양한 종류의 세포로 분화를 유도하는 연구가 진행되고 있으며 이렇게 분화된 인간 배아줄기세포를 손상된 세포를 건강한 세포로 대체하고자 하는 세포치료 (cell therapy) 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.

참고문헌 (21)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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