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문제 정의
- 본 연구에서는 질소계 악취성분 중 가장 대표적이고 유기성 폐기물의 퇴비화 공정 중에 발생하는 지정악취물질중 하나인 암모니아를 제어하기 위해 암모니아 제거 능력이 우수한 미생물을 분리 및 동정 하였으며, 분리 균주의 온도, pH, 탄소원의 농도 및 암모니아의 농도변화에 따른 최적 서식환경 조건을 조사하였다.
- 본 연구에서는 유기성 폐기물의 퇴비화에서 발생되는 악취물질 중 암모니아의 생물학적 제어를 위해 암 모니아 산화능력이 우수한 미생물을 분리 및 동정을 하였으며, 분리 균주의 최적 배양 조건 및 추후 악취처리 공정에 적용가능성에 관한 연구를 수행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 채취된 시료를 멸균생리식염수(0.85% NaCl) 에 넣고 충분히 교반 후 상등액 1 ml를 분리배지(Table 1)에 접종하여 10일간 30ºC에서 150 rpm으로 교반배양 후 배양액 0.1 ml를 동일배지에 재배양하는 방식으로 3회 반복 배양하였다.
- 반응에 사용한 universal primer는 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R(5'-TACCAGGG TATCTAATCC-3')이며, 염기서열 분석에는 ABI Prism 3730XL analyzer(96 capillary type)를 이용하였다.
- 암모니아 농도에 따른 균 성장 및 암모니아성 질소의 제거 능력을 조사하기 위하여 pH7인 배지에(NH4)2SO4가 0.1 g/l, 0.5 g/l, 1.0 g/l, 2.0 g/l 그리고 3.0 g/l로 각각 첨가 된 배지에 균을 접종하여 30ºC에서 150 rpm으로 배양하면서 시험에 사용하였다.
- pH가 7인 배지에 Glucose를 0.00%, 0.05%, 0.10%, 0.50%, 1.00% and 2.00%의 농도로 각각 첨가한 후 균을 접종하여 30ºC, 150 rpm 조건으로 배양하면서 탄소원 농도 변화에 따른 균 성장 및 암모니아성 질소의 제거 능력을 조사하였다.
- pH 변화에 따른 균 성장 및 암모니아성 질소의 제거 능력을 확인하기 위하여 pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 그리고 pH 9에서 각각 30ºC, 150 rpm 조건으로 교반배양하면서 측정하였다.
- 배양 온도 15ºC, 20ºC, 25ºC, 30ºC 그리고 35ºC에서 각각 150 rpm으로 교반배양하면서 분리된 균주의 배양온도에 따른 균 성장 및 암모니아성 질소의 제거 능력을 측정하였다.
- 분리 균주를 멸균생리식염수(0.85% NaCl)로 Mcfarland Turbidity 0.5 Standard에 맞추어 혼탁 시킨 후 100 µl를 배지 100 ml에 접종하여 15일 동안 30ºC에서 150 rpm으로 교반배양 하면서 균 성장 및 암모니아성 질소 제거 시험에 사용하였다.
- 염기서열 분석 결과는 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)을 이용하여 16S rRNA database 정보와 유사한 염기서열을 비교하였고 각각 계통분류학적 위치를 판단하였다.
- 배양중인 배지에서 12시간 간격으로 2 ml를 취하여 분광광도계(UV-Spectrophotometer:Shimadzu, UVmini1240)를 사용하여 O.D.(Optical Density) 660 nm에서균 탁도를 측정하였다.
- 바이오필터 반응기는 밀페형 구조로 내경 300 mm, 높이 1800 mm의 PVC 재질로 제작하였으며 바닥에서 300 mm 높이에 다공판을 설치하여 가스의 유입과 담 체를 지지할 수 있도록 하였다. 반응기의 하단을 통하여 퇴비화 시설 내부에 설치된 흡인 펌프와 유량계를 거쳐 정량의 악취가스가 유입되도록 하였다.
- 바이오필터 반응기는 밀페형 구조로 내경 300 mm, 높이 1800 mm의 PVC 재질로 제작하였으며 바닥에서 300 mm 높이에 다공판을 설치하여 가스의 유입과 담 체를 지지할 수 있도록 하였다. 반응기의 하단을 통하여 퇴비화 시설 내부에 설치된 흡인 펌프와 유량계를 거쳐 정량의 악취가스가 유입되도록 하였다. 담체는 바크, 나무칩, 퇴비화 시설의 부산물을 혼합하여 사용하였다.
- 담체는 바크, 나무칩, 퇴비화 시설의 부산물을 혼합하여 사용하였다. 담체를 건조와 고온멸균을 통하여 불필요한 미생물을 사멸한 다음 선별된 미생물을 접종하였다.
- 유기성 폐기물 또는 퇴비에서 채취한 시료를 동일 조건(10 day, 30ºC, pH7, 150 rpm)으로 3회 계대배양후 Griess-Ilosvay시약 test를 거쳐 분리된 균주를 평판 배지에 도말하여 30ºC에서 3일간 배양 후 활성이 높은 균주를 형태적 차이에 따라 1차 분리·선별하였다.
- 균주의 최적 배양 온도를 조사하기 위하여 배지에 Macfarland Turbidity 0.5 Standard에 맞추어 균 액을 접종하여 15ºC, 20ºC, 25ºC, 30ºC 그리고 35ºC에서15일간 배양하면서 균 성장, 암모니아성 질소의 산화능력 및 제거 효율을 시험 하였다(Fig. 6, Fig. 7 및 Fig. 8).
- 최종 선별된 균주인 Delftia sp.를 온도, pH, glucose 농도 및 암모니아 농도 변화에 따른 최적 배양 조건을 조사 하였다.
- 균주의 최적 배양 pH를 조사하기 위하여 pH를 34, 5, 6, 7, 8 그리고 9로 조절한 배양 배지에 균을 접종하여 15일간 배양 하면서 균 성장, 암모니아성 질소의 산화능력 및 제거 효율을 시험 하였다(Fig. 9, Fig. 10 및 Fig. 11).
- Macfarland Turbidity 0.5 Standard에 맞춘 균 배양액을 탄소원 농도가 0.00%, 0.05%, 0.10%, 0.50%, 1.00% 그리고 2.00%로 조절된 배지에 접종하여 15일간 배양하면서 균 성장, 암모니아성 질소의 산화능력 및 제거 효율을 조사 하였다(Fig. 12, Fig. 13 및 Fig. 14).
- (NH4)2SO4 시약으로 0.1 g/l, 0.5 g/l, 1.0 g/l, 2.0 g/l 그리고 3.0 g/l으로 각각 조절한 배지에 Macfarland Turbidity 0.5 Standard에 맞춘 균 배양액을 접종하여 15일간 배양하면서 배지의 초기 암모니아 농도 조건에 따른 균 성장, 암모니아성 질소의 산화능력 및 제거효율을 조사 하였다(Fig. 15, Fig. 16 및 Fig. 17).
- 분리된 균주의 형태학적인 특징은 광학현미경(Olympus, BX50)으로 관찰하였으며, 균주의 계통분석을 위해 1.5 ml원심분리 튜브에 분리균주와 멸균 식염수를 넣고 10,000 rpm으로 10 min 동안 원심분리 후 PCR 증폭을 하였으며, PCR증폭을 통해 얻은 추출물을 Big Dye terminator cycle sequencing kits(Applied Biosystems, Forster City, CA, U.S.A.)를 이용하여 16S rRNA Sequencing을 하였다(Fig. 2).
대상 데이터
- 반응기의 하단을 통하여 퇴비화 시설 내부에 설치된 흡인 펌프와 유량계를 거쳐 정량의 악취가스가 유입되도록 하였다. 담체는 바크, 나무칩, 퇴비화 시설의 부산물을 혼합하여 사용하였다. 담체를 건조와 고온멸균을 통하여 불필요한 미생물을 사멸한 다음 선별된 미생물을 접종하였다.
- 1차 선별된 균주를 30ºC에서 15일간 배양 후 암모니아 산화능력이 가장 우수한 균주를 최종 선별하였다.
이론/모형
- 배양중인 배지에서 12시간 간격으로 2 ml를 취하여 13,000 rpm에서 약 10분간 원심분리 후 Nessler Method8)에 따라 Spectrophotometer(HACH, DR-4000) 를 사용하여 암모니아성 질소의 농도를 측정하였다.
성능/효과
- 1) 또한 2005년 1월 1일부터 음식물 쓰레기의 직·매립 금지에 이어 2011년에는 해양배출 또한 불가능하게 될 것으로 예상된다.
- 1 ml를 동일배지에 재배양하는 방식으로 3회 반복 배양하였다.7) 3회 계대 배양된 배양액 1을 취해 Griess-Ilosvay 시약으로 NO2의 생성능 테스트 결과 발색반응이 좋은 배양액을 평판배지에 배양하여 질소화합물 산화세균을 분리하였다(Fig. 1).
- 1차 선별된 균주를 30ºC에서 15일간 배양 후 암모니아 산화능력이 가장 우수한 균주를 최종 선별하였다. 분리된 균주는 Gram 염색결과 Gram negative 구균으로 확인되었다(Fig. 3).
- 암모니아의 자연 감소를 알아보기 위하여 멸균된 배양 배지를 30ºC, pH 7, 150 rpm 조건으로 15일간 균주의 접종 없이 방치해본 결과 약 10%의 암모니아가 자연 휘발되었다(Fig. 5).
- 균 성장이 없었던 15ºC에서 1일간과 35ºC에서2일간은 암모니아의 자연 휘발로 인해 약 1%의 제거 효율을 보였으며, 15일간 배양하였을 경우 각각 67.6%, 56.1%의 제거 효율을 나타내었다(Fig. 7 및 Fig. 8).
- 암모니아성 질소 제어 효율을 확인한 결과 균주의 생육이 높았던 20ºC, 25ºC 그리고 30ºC에서 각각 86.6%, 94.3% 그리고 95.7%의 높은 제거 효율을 나타내었다.
- 따라서 15~35ºC의 온도범위에서 성장이 가능하고 최적 배양 온도가 30ºC인 중온성 미생물로 조사되었다(Fig. 6).
- 균주의 생육특성은 20ºC, 25ºC 그리고 30ºC에서균 성장이 우수 하였으며, 15ºC에서는 1일 이후 35ºC에서는 2일 이후부터 균 성장을 확인할 수 있었다.
- 균주의 생육특성 시험 결과 pH 3에서는 균이 성장하지 않았으며, pH 7, 8 그리고 9에서 균 성장률이 우수하였다. pH 5, 6에서도 균 성장을 확인할 수 있었으며, pH 4에서는 2일 이후부터 균이 성장하였지만 성장률이 저조 하였다.
- pH 5, 6에서도 균 성장을 확인할 수 있었으며, pH 4에서는 2일 이후부터 균이 성장하였지만 성장률이 저조 하였다. 따라서 pH 4~9의 범위에서 성장이 가능하고 최적 배양 조건은 pH 7~8로 조사되었다(Fig. 9). 균 접종 초기 배지의 pH가 4~9인 조건에서 암모니아성 질소의 제거 효율이 우수하게 나타났으며, 균 증식이 없는 pH 3에서는 자연 휘발된 암모니아성 질소의 감소만 보였다(Fig.
- 9). 균 접종 초기 배지의 pH가 4~9인 조건에서 암모니아성 질소의 제거 효율이 우수하게 나타났으며, 균 증식이 없는 pH 3에서는 자연 휘발된 암모니아성 질소의 감소만 보였다(Fig. 10).
- 배지의 pH별로 15일간 균주를 배양 후 암모니아성질소의 제거 효율을 조사한 결과는 다음과 같다. 균의 성장이 나타나지 않았던 pH 3에서는 암모니아가 자연 휘발되어 약 10%정도의 제어 효율이 나타났으며, pH 4,5,6,7,8,9에서는 각각 56.6%, 68.0%, 84.3%, 95.6%, 93.7%, 90.3%의 제거 효율을 보였다. pH 3인 경우를 제외하고 거의 모든 pH범위에서 생육활성 및 암모니아성 질소의 제거 능력을 나타내었으며, 최적 배양 pH조건은 균 성장 및 암모니아성 질소의 제거 효율이 가장 우수 하였던 pH 7임을 확인하였다(Fig.
- 3%의 제거 효율을 보였다. pH 3인 경우를 제외하고 거의 모든 pH범위에서 생육활성 및 암모니아성 질소의 제거 능력을 나타내었으며, 최적 배양 pH조건은 균 성장 및 암모니아성 질소의 제거 효율이 가장 우수 하였던 pH 7임을 확인하였다(Fig. 11).
- 00%에서는 균이 성장하지 못하는 종속영양세균으로 조사되었다. 0.05%에서부터 1.00%까지 탄소원의 농도가 증가할수록 균체의 성장도 증가 하였으나, 2.00%의 농도에서는 오히려 균체의 성장이 0.05%보다 감소하였다.
- 초기 암모니아 농도 조건에 따른 생육특성은(NH4)2SO4가 0.5 g/l인 배지에서는 균 성장이 빠르게 진행된 것을 확인할 수 있었으며, 0.1 g/l에서는 균주가 필요로 하는 기질의 농도가 낮아 초기 급성장 하였다가 2일 이후부터 정지기의 상태를 유지하는 것으로 나타났다.
- 13) 본 실험에 사용된 균주의 경우 1.0 g/l 이상으로 암모니아의 농도가 증가하면 균 성장률이 저감되는 것으로 조사 되었다(Fig. 15).
- 배지의 암모니아 농도에 따른 암모니아성 질소 제거 효율을 확인한 결과 (NH4)2SO4 0.1 g/l에서는 배양 후 6일 만에 90%이상의 제거 효율을 나타내었으며, 0.5g/ l, 1.0 g/l, 2.0 g/l 그리고 3.0 g/l의 농도 조건에서는 제거 효율이 각각 95.7%, 86.6%, 80.3% 그리고 69.7%로 조금씩 감소하였다. 본 실험에 사용한 Delftia sp.
- 본 실험에 사용한 Delftia sp. 는 비록 (NH4)2SO4 3.0 g/l에서 제거효율이 69.7%을 보였으나 산화된 암모니아의 농도는 약 300 mg/l이상이며 그 외 농도에서는 모두 80% 이상의 제거 효율을 나타내어 암모니아 제거 효율이 매우 우수한 균주인 것으로 조사 되었다(Fig. 16 및 Fig. 17).
- 의 최적 배양 조건을 확인한 결과 온도 30ºC, pH 7, glucose 농도 1.00%, (NH4)2SO4 0.5 g/l의 조건에서 균 성장이 가장 우수하였으며, 94% 이상의 암모니아 제거 효율을 나타내었다.
- 탄소원 농도 변화에 따른 암모니아성 질소의 산화를 조사한 결과, 균주의 성장이 없었던 0.00%에서 약10%의 암모니아 감소는 Fig. 6에서처럼 자연휘발에 의한 것으로 판단되며 0.05%~1.00%까지 탄소원이 증가할수록 암모니아성 질소의 산화 능력도 증가 하였다(Fig. 13).
- 탄소원 농도가 0.05%, 0.10%, 0.50%, 1.00%에서의 암모니아성 질소제거 효율은 각각 72.7%, 85.3%, 91.0% 그리고 95.6%로 조사 되었고, 탄소원으로 사용된 포도당이 catabolite repression작용을 하였다고 판단된 2.00%에서는 61.0%의 제거 효율을 나타내었다(Fig. 14).
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