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문제 정의
- 이에 저자는 마우스의 뇌신경교세포주인 BV-2 세포에서 연교 추출물의 항염증 효과를 조사하였으며, 매우 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- -6, ILT6 및 granulocyte macrcphage colony- stimulating factor(GM- CSF) 유전자의 발현을 억제하는데 효과가 있고27), 식중독을 유발하는 세균증식에 대해 강력한 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 9). 따라서 본 연구는 퇴행성 뇌 질환의 염증반응을 개선시키기위해 microglia 세포주인 BV-2 세포에서 연교 에탄올추출물의 염증물질 생성에 대한 억제효과를 조사하여 항염증 효과를 확인하였다.
- 본 연구에서는 뇌졸중 및 퇴행성 뇌질환의 치료를위한 한약재를 발굴하기 위해서 뇌의 염증반응에 관여하는 뇌신경교세포에서 연 교의 에탄올 추출물의 항염증효과를 실험하였으며 다음과 같은 결론을 얻었다
가설 설정
- 1. 연교 에탄올 추출물의 세포독성은 0-50您농도 범위에서는 나타나지 않았다.
제안 방법
- 발색 정도를 micro platee reader를 이용하여 550-600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 약물을 처리하지 않고 세포만 배양한 무처리구(control) 의 100% 생존율을 기준으로 상대적인 세포생률도(cell viability; %)를 계산하였다.
- Lipopolysacchaiise (LPS ; E. coli B0111 : B4 ; Sigma)에 의해 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 활성 질소 종인 nitric oxide(NO)의 농도를 세포 배양액에 존재하는 NO2「의 형태로 Griess 시약을 이용하여 검출하였다. 즉 BV-2 세포를 2><1。5 cells/W 농도로 24-well plate에 하룻밤 배양하고 연교 주줄 물을 다양한 농도로 처리한 다음 30분간 배양한 후 1 阑 LPS를 처리하여 24시간 배양하여 세포의 활성화 (activation)를 유도하였다 BV-2 세포로부터 생성된 NO의 양은 세포배양액을 수거한 다음 배양액 100 成 에 Griess 시 약(0.
- 1% NED & 1% sulfanilamide in 5% H3PO4) 10獄를 넣고 15분간 암반응 시킨 후 micrcplate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 즉정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도(UM)는 NaNO2 표준액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
- BV-2 세포에서 생성되는 전염 증사이 토카인(proinflanw」 toiy cytokine)인 TNF-a, ILTB, IL-6의 양을 DuoSet ELISA Development System R & D Systems)을이용하여 즉정하였다. 먼저 lx phosphate buffered saIine(PBS, pH 7.
- 반응을 종료시키기 위해 1M phosphoric acid 용액 50, 次를 첨가하고 microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 즉정하였다. 각 사이토카인의 농도는 표준단백질의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
- BV-2 세포로부터 NO의 합성 효소(synthease) 인 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 전염증성 사이토카인들(TNI」a, IL-1P, IL-6)의 유전자 발현에 대한 연교추출물의 조절효과를 조사하기 위해 RT-PCR을수행하였다. 즉 BV-2 세포에 다양한 농도의 연교추출물을 처리하여 30분간 전처리한 후 LPS(1 를 처리하여 6시간 동안 배양하였다.
- 5,000rpm에서 5 분깐 원심분리하여 세포를 수거한 후 TRIzol 시약 (Invitrogen™, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA와 oligo-(dT) pEmr와 Improm-H™ reverse transcriptase (Promega Co., Madison, WI, USA)를 이용하여 25℃ 에서 10분, 4 2'C 에서 60분, 70℃ 에서 15분 조건으로 cDNA를 합성하였다 합성된 cDNA에 대한 PCR을 수행하기 위해 BV-2 세포의 mRNA로부터 합성된 cDNA 1 晚 에 iNOS primerstsense; 5'-GAC CAGT ATA AGG CAA GCA C-3', antisense; 5'-CTT GTC TTT GAC CCA GTA GCC-3'], TNF-a primers [sense; 5、TTC TGT CTA CTG AAC TTC GGG GTG AT C GGT CC-3', antisense; 5eGTA TGA GAT AGC AAA TCG GCT GAC GGT GTG GG-3'], IL-1P primers [sense; 5'-ATG GCA ACT GTT CCT GAA CTC AAC T-3', antisense; 5'-CAG GAG AGG TAT AGA TTC TTT CCT TT-3'], IL-6 primers [sense; 5'-AAC ACA GCT ACG AAA ACC-3', antisense; 5'-CAG AGT ATG ATG TAA CAG TCC-3'] 및 16 bufferllO mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 250 uM dNTP, 1U Tag polymerase (Promega) 등을 혼합한 우 denaturation을 위해 9 4℃ 에서 30초, annealing을 위해 55-60℃ 에서 30초및 extension을 위해 70℃ 에서 60초 조건에서 30-35 cycles을 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조구로 GAPDHsEFw; 5r-CTC GTG GAG TCT ACT GGT GT-3, , Rv, 5JGTC ATC ATA CTT GGC AGG TT-31 를 사용하였다.
- 1% Triton X-100), 250 uM dNTP, 1U Tag polymerase (Promega) 등을 혼합한 우 denaturation을 위해 9 4℃ 에서 30초, annealing을 위해 55-60℃ 에서 30초및 extension을 위해 70℃ 에서 60초 조건에서 30-35 cycles을 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조구로 GAPDHsEFw; 5r-CTC GTG GAG TCT ACT GGT GT-3, , Rv, 5JGTC ATC ATA CTT GGC AGG TT-31 를 사용하였다.
- 즉 BV-2 세포에 연교 추출 물을 다양한 농도로 처리하여 30분간 전처리한 후 LPS(1 您/皿)를 처리하여 24시간 배양하였다. 세포를 수거하여 HBSS 용액으로 2회 세척한 다음, RIPA 용액(50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 /zg/ml 迎rotinin)으로 30분간 lysis 시켰다. 정량한 단백질(20飓)을 2x sample buffer (100 mM Tris-HCl, pH 6.
- 05% Tween이 함유된 Tris-buffered saline(TBS-T)로 l:50(广 1000 로 희석하여 상온에서 2시간 반응시켰다. Membrane 을 TBS-T로 3회 세척한 우 이차항체인 anti-rabbit IgG conjugated HRP 항체(1:1,000)와 상온에서 1시간 반응시키고 enhanced chemiluminescence kit (Amersham)를 이용하여 x-ray film에 감광시켰다.
- 사용하였다. 즉 0.1M acetic acid(pH 5.5) 2皿와 1.5灯0-4 M DPPH/ MeOH 용액 1 皿에 다양한 농도의 연교추출물 2 皿을 섞은 후 실온에서 30분간 반응 시켜 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 증류수만 넣은 대조군(control)을 기준으로 하여 자유기소거능(free radical scavenging activity; %)으로계산하였다.
- 5灯0-4 M DPPH/ MeOH 용액 1 皿에 다양한 농도의 연교추출물 2 皿을 섞은 후 실온에서 30분간 반응 시켜 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 증류수만 넣은 대조군(control)을 기준으로 하여 자유기소거능(free radical scavenging activity; %)으로계산하였다. DPPH 자유기 소거 능에 대한 양성대조군(positive control)으로 Vitamin C(50 “g/m2)를 사용하였다.
- 측정 결과는 증류수만 넣은 대조군(control)을 기준으로 하여 자유기소거능(free radical scavenging activity; %)으로계산하였다. DPPH 자유기 소거 능에 대한 양성대조군(positive control)으로 Vitamin C(50 “g/m2)를 사용하였다.
- 연교 주줄 물(FF-E extract)의 세포독성을 조사하기 위해서 다양한 농도(5-100 飓/诫)의 연교 추출물을 BV-2 세포에 처리하여 24시간 배양한 후 MTT assay를 수행하였다(Fig. 1).
- 연교 주줄 물(FF-E extract)이 LPS에 의해 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 염증매개물질인 NO 를 효과적으로 억제시킬 수 있는지 조사하기 위하여여러 농도(5-50 您/m。)의 연교 주줄물이 처리된 세포배양액으로부터 Griess 방법으로 NO의 양을 측정하였다(Fig. 2).
- 38 田\仍此로 측정되어, 유의적이고 농도 의존적으로 NO의 생성이 감소되는것으로 나타났다. 따라서 연교 추출물이 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 염증매개물질인 NO의생성을 효과耳金建 억쳬시킴쯔 확인하였다.
- LPS에 의해 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 NO의 합성효소인 iNOS의 유전자 및 단백질 발현에 대한 연교 추출물의 효과를 조사하기 위하여, RT-PCR과 Western blot을 수행하였다(Fig. 3).
대상 데이터
- 而idissima Lindl.)의 과실(Forsythiae Fructus, FF)을 (주)광명당제약(울산, 한국)으로부터 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다.
- 실험에는 ethaixlOVfen± Co, OniHny), Hpcpolysaxharide (LPS; E. coli B0111-B4; Sigma, St. Louis, MO, USA), 3-(4, 5-dimethy;lthazol-2-yl- 2, 5- teterazolium bromide) (MTL Sigma), N-trityl- 1, 3-prcpanediamine acetate (Sigma), Sulfanilamide (Sigma), Acrylamide solution(BioRad Labolatories Inc, Hercules, CA, USA), anti-iNOS monoclonal antibody(SantaCmz Co Ltd, SantaCruz CA USA), anti-(jOX-2(SantaCruz), DuoSet ELISA I凫velqpment System (R & D System Inc, Mnneeolis MN, USA) 등의 시약을 사용하였다
데이터처리
- 결과는 3회 반복실험에 대한 평균(mean)土표준오차(standard deviation; SD)로 나타내었으며, 통계학적 분석은 GraphPad Prism program의 One-way ANOVA로 검정하여 p 값이 0.05 이하인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- BV-2 세포로부터 NO의 합성 효소인 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 의 단백질 발현에 대한 연 교주 줄 물의 효과를 조사하기 위해 Western blot를 수행하였다. 즉 BV-2 세포에 연교 추출 물을 다양한 농도로 처리하여 30분간 전처리한 후 LPS(1 您/皿)를 처리하여 24시간 배양하였다.
- 활성화된 BV-2 세포로부터 분비되는 전염증성 사이토카인들(pro inflammatory cytokines)에 대한 연교 추출 물의 억제 효과를 조사하기 위해서 TNF-a, IL-1P, IL-6의 양을 세포배양액에서 ELISA 방법으로 측정하였다(Fig. 4).
- 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 전염증성사이토카인들의 유전자 발현에 대한 연교 추출물의 억제 효과를 RT-PCR 방법으로 조사하였다(Fig. 5).
- 6. Scavenging effect of FF-E extract on DPPH free radicals The effects of FF-E extract on DPPH free radicals were determined by DPPH method. Each values presait the mean土SEM of three independait experiments.
- 연교 주줄물의 자유기 (free radical) 소거능을 즉정하기 위해서 DPPH free radical 소거 효과 측정 방법을 사용하였다. 즉 0.
성능/효과
- 연교 추출물을 처리하지 않은 BV-2 세포에서는 NO가 매우 낮게 검출되는 반면(10.26±0.41 uM/mO, LPS에 의해 활성화된 세포에서는 NO의 생성이 현'저히 증가호였다(70.4±0.58 uM/meK 또한 LPS에 의해 활성화된 BV-2 세포로부터의 생성된 NO는 연교 추줄물 처리 농도 5 /zg/m£, 10 /zg/m£, 20 /zg/m£ 및 50 에서 각각 66.1±0.33 46.2±0.35 29.3+0.58 uM/m£ 및 19.9+ 0.38 田\仍此로 측정되어, 유의적이고 농도 의존적으로 NO의 생성이 감소되는것으로 나타났다. 따라서 연교 추출물이 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 염증매개물질인 NO의생성을 효과耳金建 억쳬시킴쯔 확인하였다.
- 먼저 연교 추출물을 처리하지 않고 세포만 배양한무처리군에서는 iNOS 유전자의 발현이 관찰되지 않는 반면, LPS 처리에 의해 현저히 증가되었다(Fig. 3A). 또한 LPS 처리에 의해 유도된 iNOS 유전자의발현은 연교 주줄물 20 您/W과 50 您相의 처리 농도에서 강력하게 억제되는 것으로 나타났다.
- 3A). 또한 LPS 처리에 의해 유도된 iNOS 유전자의발현은 연교 주줄물 20 您/W과 50 您相의 처리 농도에서 강력하게 억제되는 것으로 나타났다. 한편 iNOS 단백질의 발현은 유전자 발현양상과 유사하게세포만 배양한 무처리군에서는 거의 관찰되지 않는반면, LPS 처리에 의해 증가하였고, 연교 추출물에의해 현저히 억제되었다(Fig.
- 또한 LPS 처리에 의해 유도된 iNOS 유전자의발현은 연교 주줄물 20 您/W과 50 您相의 처리 농도에서 강력하게 억제되는 것으로 나타났다. 한편 iNOS 단백질의 발현은 유전자 발현양상과 유사하게세포만 배양한 무처리군에서는 거의 관찰되지 않는반면, LPS 처리에 의해 증가하였고, 연교 추출물에의해 현저히 억제되었다(Fig. 2B). 따라서 연교 추출물은 활성화된 BV-2 세포로부터 유도되는 iNOS의유전자와 단백질의 발현을 억제하여 NO의 생성을유의적으로 감소시켜 항염증 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 2B). 따라서 연교 추출물은 활성화된 BV-2 세포로부터 유도되는 iNOS의유전자와 단백질의 발현을 억제하여 NO의 생성을유의적으로 감소시켜 항염증 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 먼저 BV-2 세포만 배양한 무처리군의 TNF-a 생성량은 9.25+0.32 pg/m£ 농도로 매우 낮게 검출된 반면, LPS 처리 후 759.90±23.96 pg/m£ 농도로 현저히증가하였다 또한 LPS에 의해 증가된 TNF-a의 분비는 연교 주줄물 5 您/畝 10 飓/毗 20 /zg/m£ 및 50 您/i此 농도에서, 각각 752.9±50.58 pg/m£, 448.8+12.47 pg/m£, 256.7±4.83 pg/m£ 및 67.7±1.61 pg/ni。로 검줄되어, 연교추출물 처리농도에 의존적으로 TNF-a의생성이 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 4A).
- 7±1.61 pg/ni。로 검줄되어, 연교추출물 처리농도에 의존적으로 TNF-a의생성이 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 4A).
- 69 pg/m。로 검줄되었다. 즉 연교 추출물의 처리 농도에 의존적이며 유의적으로 BV-2 세포로부터 IL-6의 분비가 억제되었다(Fig. 4C). 따라서 연교 추출물은 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 전염증성 사이토카인들인 TNF-a, IL-1P, IL-6를 유의적으로 억제시켜서 항염증 효과를 나타냄을 알 수 있었다
- 4C). 따라서 연교 추출물은 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 전염증성 사이토카인들인 TNF-a, IL-1P, IL-6를 유의적으로 억제시켜서 항염증 효과를 나타냄을 알 수 있었다
- BV-2 세포에서 LPS 처리에 의해 증가된 TNF-a, IL-1P, IL-6의 유전자 발현은 연교 추출물의 처리농도 50飓/1此에서 현저히 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 연교 추출물은 활성화된 BV-2 세포에서 전염증성 사이토카인들의 유전자 발현을 억제하여 TNF-a, IL-1。, IL-6의 생성을 유의적으로 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
- IL-1。, IL-6의 생성을 유의적으로 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
- 연교 추출물의 자유기 소거 능을 DPPH free radical 소거 활성도를 통해 조사한 결과(Fig. 6), 연교 추출물을 처리하지 않은 대조군에서는 2.01 ± 0.43%로 소거 효과가 거의 나타나지 않는 반면, vitamin C(50 您海)를 처리한 경우에는 54.9+1.43% 의 소거효과가 나타났다. 한편 연교 추출물 5 您 10 您/m。, 20 /Zg/m£ 및 50 /zg/m£ 처리 농도에서는 각각 11.
- 43% 의 소거효과가 나타났다. 한편 연교 추출물 5 您 10 您/m。, 20 /Zg/m£ 및 50 /zg/m£ 처리 농도에서는 각각 11.01±0.11%, 11.16+2.97%, 19.3+3.43% 및 37.97±0.08%로 측정되어 DPPH 자유기 소거효과가연교 추출물의 처리 농도에 의존적이고 유의적으로증가되는 것으로 나타났다.
- 따라서 염증반응이 진행되는 동안 유의적으로 증가하는 NO 생성을 효과적으로 억제하는 억제제 개발에 대한 연구가 최근 이루어지고 있으며 다양한 염증 질환의 유용한 치료 방법으로 여겨지고 있다28劉. 본 연구에서 연교 추출물은 NO 합성효소인 iNOS의 유전자 및 단백질 발현을 蠹과적으로 억제시켰으며, 이蠶 연교 추출물이 Nos의 발현을 전사단계에서 조절하여 iNOS 생성을 억제시키고 나아가 NO 생성을 효과적으로 감소시키는 것으로 보인다. 생체 내 과도한 NO 생성은 오히려 세포를 파괴하고 shock에 의한 혈관 확장 및 염증반응을 촉진하여 조직에 독성으로 작용하여 손상을 유발하게 된다 따라서 본연구결과를 통해 iNOS 발현을 차단함으로써 NO 생성을 억제시킬 수 있는 연교 추출 물이 다양한 염증성 질환 치료에 매우 효과적일 수 있음을 알 수 있었다 비록 천연물의 iNOS 생성에 대한 세포기 전이 정확히 밝혀져 있지는 않지만, NO 생성을 억제하는 약물의 경우 전처리가 iNOS promoter activity 를 억제하거나 iNOS 유전자의 전사 (transcription)를 억제하는 것으로 알려져 있다矛3®
- 본 연구결과에서 연교 추출물은 BV-2 세포에서 LPS 에 의해 유도되는 TNF-a, IL-1。, IL-6 와 같은 전염증성사이토카인의 유전자 발현을 조절하여 세포로부터의 분비를 유의적으로 감소시켰다. 즉 연교 에탄올 추출물은 각종 뇌 질환의 염증 유발의 중심에 있는 micro읺ia의 활성화와 이로부터 분비되는 중요한 염증 매개 물질들인 NO, iNOS 및 전염 증사이 토카인들의유전자 발현단계를 조절하여 이들의 생성을 효과적으로억제시킬 수 있음을 알 수 있으며, 이는 연교 추출물이 강력한 항염증 효과를 통해 뇌염증(neuroinflammation) 과 관련된 각종 뇌 질환의 치료에 이용될 수 있음을 시사한다. 따라서 연교의 에탄올추출물은 단독 또는 기타 단미 한약재와의 혼합을 통해 각종 퇴행성 뇌 질환 및 뇌졸중 개선을 위한 한방치료제로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
- 2. LPS에 의해 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 염증매개물질인 NO는 연교 에탄올 추출물의처리 농도에 의존적이고 유의적으로 감소되었다
- 3. LPS에 의해 활성화된 BV-2 세포로부터 유도되는 NO 합성효소인 IONS의유전자와 단백질의 발현은 연교 에탄올 추출물에 의해 효과적으로 억제되었다
- 4. LPS에 의해 활성화된 BV-2 세포에서 생성되는 전염증성 사이토카인들(TNF-a, IL-1P, Ⅱ.-6) 은연교 에탄올 추출물의 처리 농도에 의존적이고 유의적으로 감소되었다.
- 5. LPS에 의해 활성화된 BV-2 세포에서 생성되는 TNF-a, IL-IB, IL-6의 유전자 발현은 연교 에탄올 추출물에 의해 효과적으로 억제되었다.
- 6. 연교 에탄올 추출물은 DHHP 자유기를 농도 의존적으로 소거하였다
후속연구
- 즉 연교 에탄올 추출물은 각종 뇌 질환의 염증 유발의 중심에 있는 micro읺ia의 활성화와 이로부터 분비되는 중요한 염증 매개 물질들인 NO, iNOS 및 전염 증사이 토카인들의유전자 발현단계를 조절하여 이들의 생성을 효과적으로억제시킬 수 있음을 알 수 있으며, 이는 연교 추출물이 강력한 항염증 효과를 통해 뇌염증(neuroinflammation) 과 관련된 각종 뇌 질환의 치료에 이용될 수 있음을 시사한다. 따라서 연교의 에탄올추출물은 단독 또는 기타 단미 한약재와의 혼합을 통해 각종 퇴행성 뇌 질환 및 뇌졸중 개선을 위한 한방치료제로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
- 따라서 연교 에탄올 추출물은 뇌신경교세포인 BV-2 세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증매개물질들의 유전자 전 사단계를 조절하여 그 생성을 억제하여 항염증효과를 나타내며, 이는 연교가 뇌졸중이나각종 퇴행성 뇌 질환의 예방 또는 개선을 위한 치료제로 개발될 수 있음을 시사한다
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